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Génotypages Souris Rosa-DiCre

Génotypage spécifique des souris Rosa-DiCre (PLoS ONE. 2007 ;2(12) :e1355)

PRINCIPE

Amplification spécifique de la jonction Cre59 SV40 polyA.

Rem : Pour la détermination d’homozygotie, voir le protocole AP005.


 

PROCEDURE PCR

Marqueur Amorces Taille amplicon (bp)
ADN Rosa-DiCre
(iCre59-SV40pA)
Pr236 acctctgatgaagtcaggaagaa
Pr264 ccacaactagaatgcagtga
411 bp

Mélange réactionnel : Taq Platinium Invitrogen (ref 10966034)

Volumes pour 1 réactionVolumes pour 25 réactions
Tampon Taq Platinium (sans MgCl2) 2 50
dNTP 10 mM 0,4 10
Primers à 10 pmol/µl (0,4 + 0,4) (10 +10)
MgCl2 50 mM ( vol pour 3mM final) 1,2 30
BSA 10 mg/ml (Biolabs) 1 25
Taq Platinium 0,08 2
H2O qsp 19 µl 13,52 340

Assemblage à RT, 19 µl par tube PCR de 250 µl
Ajouter 1 µl échantillon ADN HotShot (Truett et al., Biotechniques 29:52-54, 2000).
35 cycles, température d’annealing : 57°C, durée d’élongation 30"

RESULTATS ATTENDUS

Exemple à trois température d’annealing, sur ADN DiCre (positif) et Cre2ERT2 (négatif)

VARIANTES POSSIBLES

Mêmes conditions avec un des deux couples suivants :

Marqueur Amorces Taille amplicon (bp)
portion de FRB-Cre60 (une amorce sur chaque domaine) Pr109 ttaatggaggcccaagagtg
Pr235 gcatccacattctcctttctg
344 bp
idem, autre portion Pr280 ttggggaaaggaacgtgaaagg
Pr279 aggtgctgttggatggtcttca
355 bp

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