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Etude de protéines membranaires par résonance plasmonique (...)

Etude de protéines membranaires par résonance plasmonique de surface

Applications à l’analyse protéomique des vésicules synaptiques et au dosage de neurotoxines clostridiales

Localisées à l’interface de compartiments subcellulaires distincts, les protéines membranaires assurent des fonctions essentielles et constituent des cibles pharmacologiques primordiales. Peu abondantes, elles sont partiellement enrichies au sein de domaines spécifiques. De par leur propriété hydrophobe, ces protéines sont difficilement analysables et quantifiables par des méthodes biochimiques conventionnelles. Nous montrons dans ce travail, portant sur l’étude de protéines des vésicules synaptiques, que l’utilisation de biocapteurs optiques fondés sur la résonance plasmonique de surface (SPR) peut constituer une approche de choix pour l’analyse des protéines membranaires.

Les vésicules synaptiques transportent et libèrent les neurotransmetteurs au niveau de la fente synaptique en fusionnant avec la membrane plasmique en réponse à un signal calcique. La VAMP2 protéine membranaire de la vésicule synaptique, joue un rôle central dans le mécanisme de fusion en interagissant avec des partenaires localisés dans la membrane présynaptique (syntaxine 1 et SNAP25). Ces trois protéines, appelées protéines SNARE, forment un complexe hétérotrimérique dont la formation est régulée par la calmoduline.

Nous démontrons que la présence d’un environnement lipidique acide influe sur la conformation et la fonction de la protéine VAMP2. En réalisant sur biocapteur une carte des épitopes de la protéine VAMP2 incluse dans des protéoliposomes, nous observons une perte d’accessibilité du domaine juxta-membranaire (acides aminés 77-90) résultant notamment de l’interaction de ses deux résidus tryptophanes avec les lipides acides adjacents. Associés à des études biochimiques complémentaires, ces résultats permettent d’élaborer un nouveau modèle de régulation de la fusion membranaire : la calmoduline, en présence de calcium, déplacerait le domaine 77-90 de la surface des vésicules synaptiques vers la membrane plasmique, facilitant ainsi le rapprochement des deux feuillets membranaires dans une étape préalable au processus de fusion.

D’autre part, nous avons développé une nouvelle méthodologie dans laquelle des vésicules synaptiques intactes sont immobilisées en une seule étape sur les biopuces. Cette configuration « vesicle chips » permet de proposer une approche simple pour l’étude protéomique différentielle et/ou fonctionnelle des composants membranaires des vésicules synaptiques et pourrait être étendue à d’autres types d’organelles.

L’analyse SPR des taux d’immuno-capture des vésicules synaptiques permet également de proposer une nouvelle méthode de dosage extrêmement sensible de leurs composants membranaires, sans recours à la solubilisation, à partir de faibles quantités d’échantillons (neurones en cultures, coupes de cerveau, biopsies). Une étude préliminaire montre que cette technique pourrait permettre de détecter des marqueurs neuronaux dans des carcinomes de type neuro-endocrine.

Les neurotoxines clostridiales, substances biologiques les plus toxiques connues à ce jour, inhibent la neurotransmission synaptique en clivant les protéines SNARE. Leur utilisation croissante comme agent thérapeutique mais aussi le risque potentiel qu’elles constituent en tant qu’arme biologique, justifient l’élaboration de nouveaux tests de dosage in vitro. La mesure par SPR de l’immuno-capture de vésicules synaptiques préalablement exposées aux neurotoxines nous a permis d’établir des méthodes de dosages de leurs activités protéolytiques. Concernant la BoNT/B, ce test s’avère être 200 fois plus sensible et jusqu’à 25 fois plus rapide que le test de référence de létalité in vivo chez la souris.

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