Plates-formes PFRN

Troisième session

C1 : Effet antalgique des toxines alpha et beta de scorpion

Martin-Eauclaire MF1, Abbas, N1*, Sauze N1, Mercier L2, Bergé-Lefranc JL2, Condo J3, Bougis P-E1, Guieu R3

1CNRS UMR 6231, CRN2M, Université de la Méditerranée et Université Paul Cézanne, Faculté de Médecine - Secteur Nord, CS80011, Bd Pierre Dramard, 13344 Marseille Cedex 15, France. 2Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, CHU Timone/Conception, Bd Baille, 13005, Marseille, France. 3Laboratoire de Biochimie et d’Hormones Protéiques, Faculté de Médecine Timone, Bd Jean Moulin, 13005, Marseille, France. *Personne de l’équipe TOXCiM donnant la communication orale

L’effet antalgique des venins de scorpion a été décrit et observé en médecine traditionnelle chinoise. Cet effet est particulièrement paradoxal, sachant que les patients envenimés au grade I après piqûre de scorpion se plaignent en priorité d’une douleur intense au site de piqûre. Des études pharmacologiques publiées récemment dans la littérature attribuent cette action analgésique à des toxines qui s’avèrent être toutes des toxines de type bêta douées d’une action spécifique sur le système nerveux d’insecte et montrant une parfaite innocuité pour le mammifère. Nous disposons dans l’équipe d’une batterie de ces toxines, parfaitement caractérisées sur le plan chimique, immunologique et pharmacologique. Les réponses en électrophysiologie obtenues sur leurs cibles, des canaux sodium activés par le voltage, clonés et exprimés dans l’ovocyte de xénope, sont aussi parfaitement décrites. Ces toxines sont dépourvues totalement d’activité toxique sur le mammifère, ce qui permet leur utilisation par voie périphérique (injection intra-péritonéale), même à forte dose. Désirant vérifier l’existence des effets analgésiques décrits pour les toxines bêta anti-insectes, nous avons entrepris une étude permettant d’évaluer leur pouvoir analgésique chez la souris par des tests de « hot-plate » et de « tail-flick ». Les tests ont ensuite été étendus à certaines toxines de type alpha. Les effets obtenus ont été quantifiés et comparés à ceux observés après injection d’antalgiques utilisés en médecine humaine ou d’agents chimiques nociceptifs divers. Nous avons également étudié l’effet des toxines sur l’expression des ARNm du proto-oncogène C-Fos au niveau des cordons postérieurs de la moelle spinale, en comparant les résultats obtenus avec ceux que donnent divers stimuli douloureux. Nous avons montré que les toxines utilisées, qu’elles soient de type alpha ou bêta, induisaient un effet antalgique puissant et dose-dépendant et augmentaient largement l’expression de l’ARNm de C-Fos. Des études complémentaires se poursuivent actuellement pour tenter de comprendre au niveau moléculaire les mécanismes responsables des effets anti-nociceptifs observés.

C5 : Ankyrin G controls the diffusion barrier at the axonal initial segment

Anna Brachet, Christophe Leterrier, Daniel Choquet, Bénédicte Dargent

INSERM 641 - IFR Jean Roche - Marseille France

In neurons, generation and propagation of action potentials require the precise accumulation of sodium channels at the axonal initial segment (AIS) and in the nodes of Ranvier through ankyrin G scaffolding. The AIS also forms a non specific diffusion barrier that restricts the surface mobility of membrane proteins and phospholipids. Genetic, biochemical and cell biology studies converge to a crucial role of ankyrin G, as the key player in organizing the AIS. Moreover, ankyrin G and sodium channel accumulation at the AIS is linked with the formation of the diffusion barrier. In the present study, we used a single particle tracking strategy to unravel the role of specific protein-protein interactions in the formation of a diffusion barrier. Difficulties in expressing full Nav1.2 led us to generate chimeric ion channel Kv2.1-Nav1.2 as a suitable tool. The Nav1.2 fragment bears the ankyrin binding motif of sodium channels. We observed that the lateral diffusion of Kv2.1-Nav1.2 is highly restricted at the AIS of mature hippocampal neurons. We determined the critical residues involved in sodium channel-ankyrin G interaction and their effect on Kv1.2-Nav1.2 diffusion. We further studied Kv2.1-Nav1.2 diffusion in young neurons, where no barrier is yet form. In these conditions Kv2.1-Nav1.2 diffusion is also severely restricted at the AIS, pointing to the crucial role of ankyrin G in restricting sodium channel diffusion. Pharmacological inhibition of casein kinase 2 impacted Kv2.1-Nav1.2 immobilization. Our findings revealed that the ankyrin dependant barrier forms before the previously described non specific diffusion barrier.

C6 : Spontaneous GABAergic Activity Tunes Action Potential Discharge Fidelity

Olivier Caillard

INSERM 641 - IFR Jean-Roche - Marseille France

Even in the simpler in vitro preparations of neuronal cells, a non negligible source of variability in action potential discharge can be observed for a constant given stimulus. This lack of full fidelity results from stochastic properties of the different voltage-dependent ion channels that directly or indirectly take part in action potential genesis. In vivo, cortical neurons are continuously bombarded by synaptic release of neurotransmitters that drive neuronal cell firing. Spontaneous activity may have then a significant impact on action potential discharge fidelity. In the present study I have characterized L2/3 pyramidal discharge in neocortical acute slices, and studied the relationship between discharge fidelity and action potential firing rate. The impact of GABAA spontaneous activity on excitability and fidelity was then addressed either on L2/3 recorded cells, when injecting dynamic clamp patterns mimicking synaptic GABAA activity recorded in vitro, or in an integrate and fire model. Results obtained show that for levels of spontaneous activity that affect poorly the relationship between firing rate and DC current, fidelity of discharge can be significantly affected. Thus spontaneous GABAergic activity is ready to disorganize as well as inhibit or shunt firing. Such mechanism gives to GABA a new subtle but genuine facet that could strongly influence the tuning of neuronal network activities.

C9 : V-ATPase membrane sector associates with synaptobrevin to mediate neurotransmitter release

Jérôme Di Giovanni,1 Sami Boudkkazi, 1 Sumiko Mochida,2 Nada Samari,1 Christian Lévêque,1,3 Fahamoe Youssouf,1 Aline Brechet,1 Cécile Iborra,1 Yves Maulet,1 Dominique Debanne,1 Michael Seagar,1 & Oussama El Far,1 1INSERM U641, Marseille, F-13916 France 1Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine secteur nord, IFR 11, Marseille, F-13916 France 3Centre d’Analyse Protéomique de Marseille (CAPM), IFR 11, Marseille F-13916, France 2Department of Physiology, Tokyo Medical University, Tokyo 160-8402, Japan

Acidification of synaptic vesicles by the vacuolar proton ATPase (V-ATPase) is essential for loading with neurotransmitter. Debated findings in the 1980s suggested that the V-ATPase membrane domain (V0) also contributes to Ca2+-dependent acetylcholine release. Recent data support a direct role for V0 in vesicle membrane fusion, but the underlying mechanisms remain obscure. Here we identify a direct interaction between V0 c-subunit and the v-SNARE VAMP2 which constitutes a molecular link between the V-ATPase and SNARE-mediated fusion. Interaction domains were mapped to the membrane-proximal domain of VAMP2 and a cytosolic loop of c-subunit. Acute perturbation of this interaction with c-subunit loop peptides did not affect synaptic vesicle proton pump activity but induced a substantial decrease in release probability, inhibiting glutamatergic as well as cholinergic transmission in mammalian cortical slices and cultured sympathetic neurons respectively. Thus, V-ATPase V0 sector ensures two independent functions : proton transport by a fully assembled V-ATPase and a role in SNARE-dependent exocytosis.

C10 : Les interactions moléculaires dans le système nerveux central : méthodes d’étude, mécanismes moléculaires et signification physiologique.

Jacques Fantini

Les lipides représentent environ 50% du poids sec d’un cerveau. Ils en sont ainsi les composés organiques les plus abondants. Biochimiquement, ils se répartissent en 3 catégories : les acides gras et leurs dérivés, les sphingolipides et le cholestérol. On les trouve principalement dans les membranes cellulaires, mais certains d’entre eux sont de véritables messagers intercellulaires porteurs d’information biologique. C’est le cas par exemple des endocannabinoïdes (anandamide, 2-arachidonoylglycérol et molécules dérivées). Quelle que soit la structure biochimique de ces lipides, ils agissent essentiellement dans un environnement membranaire, où ils interagissent soit avec d’autres lipides, soit avec des protéines, et souvent avec les deux simultanément. Ces différents types d’interaction moléculaire obéissent à deux règles majeures : la complémentarité géométrique et la compatibilité chimique. Les interactions de van der Waals sont donc prépondérantes. Parmi les nombreux complexes lipide-lipide, citons le cholestérol qui interagit préférentiellement avec les sphingolipides, provoquant ainsi la ségrégation de ces lipides dans des microdomaines condensés spécialisés dans la transduction du signal. Ce même cholestérol est également impliqué dans l’insertion membranaire de l’anandamide et son transport vertical (transmembranaire) et horizontal (adressage aux récepteurs de type CB1). Les méthodes d’étude de ces interactions nécessitent de recréer des systèmes supramoléculaires organisés mimant la structure membranaire : monocouches à l’interface eau-air, films lipidiques noirs, liposomes. La modélisation moléculaire est de plus en plus utilisée en amont ou en aval de ces méthodes biophysiques. Des exemples concrets de l’utilisation concertée de ces différentes techniques d’investigation seront présentés et discutés.

C4 : Pourquoi continuer à les appeler Natural Killer ?

O. Cedile, N Popa, F. Pelletier, M. Djelloul, J. Boucraut

Les cellules Natural Killer (NK) représentent entre 2 et 3% des cellules circulantes chez les souris C57BL/6. Les cellules NK sont connues éliminer des cellules tumorales et des cellules infectées. Elles ont également la capacité de sécréter des cytokines, des chimiokines et des neurotrophines et donc de moduler les réponses immunes innées et adaptatives et d’agir sur les cellules neurales en cas de recrutement dans le SNC. Leurs fonctions sont finement régulées par leurs récepteurs inhibiteurs et activateurs qui reconnaissent des ligands exprimés par les cellules « cibles » dont la plupart appartiennent à la famille des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I. Les molécules du CMH-I sont classiquement non ou peu exprimées dans le SNC adulte. Notre équipe analyse (1) l’expression des membres de la famille du CMH-I par les cellules neurales et (2) le recrutement et les rôles des cellules immunes dans le SNC pathologique. Nous avons en particulier montré que Rae-1, ligand du récepteur activateur NKG2D, était exprimé de manière constitutive dans les zones de neurogenèse et induit en condition pathologique. Dans cette présentation, nous caractérisons dans le modèle de la SEP, l’EAE, et dans un modèle de lésion chimique des neurones olfactifs, le recrutement de cellules immunes dans le SNC, et notamment celui des NK. Nous avons également étudié en parallèle l’expression des ligands de NKG2D. Par une approche de déplétion des cellules NK, nous montrons enfin que les cellules NK jouent un rôle neuroprotecteur. L’objectif à terme est de proposer des approches thérapeutiques neuroprotectrices en modulant les fonctions de ces cellules ou en favorisant leur recrutement dans le SNC.

RESUME NON COMUNIQUE

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