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Première session

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C15 : Rôle des molécules d’adhérence cellulaire dans la formation des jonctions axo-gliales

Labasque Marilyne et Faivre-Sarrailh Catherine

CRN2M, UMR 6231 CNRS-Université de la Méditerranée, Marseille.

La myélinisation est un processus d’importance assurant une conduction rapide, de type saltatoire, des impulsions nerveuses. Les contacts entre les cellules gliales myélinisantes et les axones génèrent des domaines axonaux spécialisés (nodal, paranodal et juxta-paranodal) au niveau de la région des nœuds de Ranvier. Ces domaines présentent une composition hautement spécifique en canaux ioniques, molécules d’adhérence cellulaire et protéines du cytosquelette, Les canaux sodiques-dépendants du voltage, responsables de la conduction du potentiel d’action, sont ainsi très enrichis au niveau de la région nodale en association avec un membre de la superfamille des immunoglobulines, la molécule NrCAM. Les régions paranodales, situées de part et d’autre des nœuds de Ranvier, correspondent à des jonctions de type septé qui ancrent les boucles terminales des cellules gliales myélinisantes à la membrane axonale. Cette interaction neurone-glie au niveau paranodal fait intervenir deux molécules d’adhérence cellulaire que sont la contactine et Caspr/paranodine, appartenant respectivement à la superfamille des immunoglobulines et la famille des neurexines. La région juxta-paranodale regroupe quant à elle des canaux potassiques dont l’insertion à la membrane requiert l’interaction indirecte avec un autre membre de la famille des neurexines désigné Caspr2. Une question majeure concerne les mécanismes mis en jeu par les neurones pour délivrer les protéines membranaires nouvellement synthétisées du corps cellulaire aux différents domaines que composent les nœuds de Ranvier. Dans ce contexte, nous nous intéressons plus particulièrement au renouvellement à la surface cellulaire des glycoprotéines axonales incluant NrCAM, la contactine, Caspr/paranodine et Caspr2. L’adressage du complexe paranodine/contactine à la surface cellulaire étant dépendante de la N-glycosylation, nous avons étudié la nature du ou des sites de glycosylation de la contactine impliqués dans ce processus. L’état de glycosylation de la contactine joue également un rôle dans l’interaction avec la neurofascine 155 (Nf155), un de ses partenaires présent au niveau glial. Récemment, les domaines immunoglobulines de la Nf155 impliqués dans l’interaction avec la contactine ont été identifiés, un travail auquel nous avons participé et qui sera également évoqué.

C19 : Expression et sécrétion différentielle des MMPs et de leurs inhibiteurs endogènes les TIMPs dans les astrocytes

Oualid Sbai, Adlane Ould-yahoui, Lotfi Ferhat, Yatma Gueye, Anne Bernard, Eliane Charrat, Ali Mehana, Jean-Jacques Risso1, Jean-Paul Chauvin2, Emmanuel Fenouillet, Santiago Rivera, Michel Khrestchatisky.

NICN, UMR 6184 CNRS-Université de la Méditerranée, Marseille. 1 Département de Recherche Marine et Subaquatique, IMNSSA, UMR MD2 PPCOE, Université de la Méditerranée, Toulon Armées. 2 Plateforme de Microscopie Electronique, IBDML, UMR 6216 CNRS-Université de la Méditerranée, Marseille.

Les astrocytes jouent un rôle important dans le système nerveux central (SNC) et sont impliqués dans la migration neuronale, les processus neuroinflammatoires, la cicatrisation du tissu nerveux après lésion etc. Parmi les nombreuses molécules impliquées dans ces processus, on trouve les métalloprotéases matricielles (MMP) et leurs inhibiteurs endogènes, les inhibiteurs tissulaires de MMPs (TIMPs). Le système MMP/TIMP est un des principaux régulateurs de l’espace péricellulaire via le clivage de nombreuses cibles protéiques, notamment les composants de la matrice extracellulaire, les protéines d’adhérence, les cytokines, les récepteurs et molécules de surface cellulaire. La réactivité gliale induite in vitro par des agents pro-inflammatoires est associée à une modulation de l’expression et/ou de l’activité des membres du système MMP/TIMP. Cependant, rien n’est connu concernant la distribution intracellulaire et les voies de sécrétion des MMPs et des TIMPs dans les astrocytes. En combinant des approches de biologie cellulaire et moléculaire, de biochimie et d’imagerie, nous avons entrepris une étude de la distribution intracellulaire, du transport et de la sécrétion de MMP-2, MMP-9, et leurs inhibiteurs TIMP-1 et de TIMP-2 dans des astrocytes en culture. Cette étude a permis de démontrer notamment une localisation nucléaire de MMP-2 et MMP-9, et une distribution vésiculaire différentielle des MMPs par rapport aux moteurs moléculaires myosine V et kinésine. Nous montrons aussi que les vésicules MMP-9 sont de nature lysosomale et que les MMPs et les TIMPs sont sécrétés en partie sous forme vésiculaire dans le milieu extracellulaire. Ainsi, nos résultats suggèrent que ces protéases et leurs inhibiteurs utilisent différentes voies de transport et de sécrétion associées à différentes fonctions astrocytaires.

C7 : Couverture gliale des synapses glutamatergiques du noyau du tractus solitaire.

Kéodavanh Chounlamountry, Virginie Penalba, Fabien Tell et Jean-Pierre Kessler

CRN2M - Département de Signalisation neuronale - Equipe « Intégration des informations viscérales »

Le noyau du tractus solitaire (NTS) est un relais sensitif situé en région médio-dorsale du bulbe rachidien qui constitue la principale porte d’entrée des informations viscérales. Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur dans le NTS. Or on sait que les astrocytes jouent un rôle important dans la transmission glutamatergique en assurant l’inactivation du transmetteur par recapture. La disposition des prolongements astrocytaires au niveau des synapses est donc un facteur important qui va permettre de réguler la diffusion du glutamate hors de la fente synaptique. Nous avons donc étudié les relations existant entre les prolongements astrocytaires et les synapses glutamatergiques du NTS en utilisant la microscopie électronique associée à des méthodes stéréologiques et à de la reconstruction tridimensionnelle. Les prolongements astrocytaires ont été identifiés à partir de critères morphologiques et/ou par immunomarquage du transporteur du glutamate GLT1 (spécifiquement exprimé par les astrocytes). Les reconstructions tridimensionnelles ont été réalisées à partir coupes sériées ultra-fines (en moyenne 40 coupes de 80nm) et en utilisant lelogiciel Reconstruct. L’étude stéréologique montre que, dans le NTS, le compartiment astrocytaire est bien développé. Il occupe 15% du volume total et la densité des membranes d’astrocytes est de 2,77µm²/µm3. Les images obtenues indiquent cependant que les synapses glutamatergique du NTS ne sont pas toutes totalement enrobées par les processus astrocytaires. Nous avons donc réalisé une étude quantitative à partir de reconstructions tridimensionnelles. Cette étude portant sur 48 jonctions synaptiques reconstituées montre que la couverture de la zone de contact entre les éléments pré- et post-synaptiques par les prolongements astrocytaires est en générale incomplète. Elle est très variable d’une synapse à l’autre et occupe en moyenne 47+/-26 % du périmètre périsynaptique. De plus, il existe une différence significative entre les synapses « simples » et celles impliquées dans des formations complexes de type rosette ou glomérule. En effet, les premières sont en moyenne plus couvertes (66+/-21% du périmètre périsynaptique) que les secondes (43+/-26% du périmètre périsynaptique). Il existe donc dans le NTS deux populations de synapses glutamatergiques : des synapses simples relativement isolées par les processus astrocytaires et des synapses impliquées dans des formations complexes à partir desquelles le glutamate va pouvoir diffuser et induire des phénomènes de crosstalk ainsi qu’une activation de récepteurs extrasynaptiques.

C20 : Biophysical properties of substantia nigra dopaminergic neurons in organotypic cultures

Adele WOODHOUSE

Dopaminergic neurons are pacemaker cells that generate spontaneous activity, both in vivo and in vitro. In acute slices, these neurons generally fire action potentials at regular frequencies. Dopaminergic neurons also display spontaneous activity in organotypic cultures, which can vary from regular firing to irregular firing, and to a lesser extent bursting behavior. However, the precise mechanisms underlying these types of firing in organotypic slices are still to be determined. In the present work, we studied the changes in biophysical properties of dopaminergic neurons in organotypic cultures and how these changes relate to the firing pattern of the cell. We analyzed the properties of several intrinsic conductances (including the H-type and A-type currents) that are likely to be involved in the generation of spontaneous activity of substantia nigra dopaminergic neurons in both acute and organotypic slices. Organotypic cultures were prepared from P6-P7 rats and maintained for 1 to 2 weeks in vitro before electrophysiological recordings were obtained. Dopaminergic neurons in organotypic slices exhibited the expected spontaneous regular, irregular and burst firing as well as strong spontaneous synaptic activity. In contrast, robust spontaneous synaptic activity was rarely observed in dopaminergic neurons in acute slice preparations. Although some of the dopaminergic neurons in organotypic cultures displayed a spontaneous regular firing pattern very similar to that observed in acute slices, their biophysical properties were significantly altered. For instance, we determined that the amplitude of the H-type current was, on average, decreased in regularly firing dopaminergic neurons in organotypic cultures compared to regularly firing dopaminergic neurons in acute slices, and the properties of the A-type current were also altered in the cultured preparation. These results suggest that substantia nigra dopaminergic neurons are able to regulate their conductances in organotypic cultures to achieve spontaneous firing patterns similar to those observed in acute slices. Thus, depending on their environment, neurons are capable of finding different biophysical solutions to produce appropriate information output.

C2 : Le récepteur somatostatinergique sst2 diminue la viabilité cellulaire et l’hypersécrétion hormonale et améliore la sensibilité à l’octréotide pour les adénomes hypophysaires humains.

Julie Acunzo1, Sylvie Thirion1, Catherine Roche1, 2, Alexandru Saveanu1,2,7, Ginette Gunz1, Anne Laure Germanetti2, Bettina Couderc3, Richard Cohen4, Dominique Figarella-Branger5, Henry Dufour6, Thierry Brue7, Alain Enjalbert1,2, Anne Barlier1,2,7

1Centre de recherche en Neurobiologie-Neurophysiologie de Marseille, UMR 6231 CNRS, Institut Fédératif Jean-Roche, Université de la Méditerranée, Marseille. 2Laboratoired de Biochimie et Biologie Moléculaire, Centre Hospitalo-Universitaire Conception, Marseille, France. 3 INSERM U563 Institut Claudius Regaud Toulouse 4 Laboratoire de Radio-isotopes et immunoanalyse, Fondation Biochimique, Hôpital Edouard Herriot, Lyon 5Laboratoire of Neuropathologie, Centre Hospitalo-Universitaire Timone, Marseille. 6Departement de Neurochirurgie, Centre Hospitalo-Universitaire Timone, Marseille. 7 Département d’Endocrinologie, Centre Hospitalo-Universitaire Timone, Marseille.

Pour adénomes hypophysaires somatotropes, l’hypersécrétion de GH (hormone de croissance) peut être réduite par des traitements médicaux représentés par les analogues de la somatostatine, comme l’octréotide. Malheureusement, les niveaux de GH sont normalisés uniquement chez 60% des patients traités. La résistance à l’octréotide est fortement reliée à des faibles niveaux d’expression du récepteur somatostatinergique sst2. Dans cette présente étude, le gène sst2 a été transféré à l’aide de vecteurs adénoviraux (Ad-sst2) dans des adénomes somatotropes (n=7) et lactotropes (n=2) humains in vitro. L’expression de sst2 au niveau du messager et de la protéine augmente d’une manière significative après infection. Dix jours après infection à 10 MOI (multiplicity of infection), le transfert du gène sst2 induit une baisse de la viabilité cellulaire de 19% à 90% par une apoptose dépendante de l’activité de caspases effectrices. A faible dose virale (5 MOI), Ad-sst2 diminue la sécrétion basale des hormones GH et prolactine (PRL) mais également leur expression. Les adénomes somatotropes ont été classés en 3 groupes selon leur sensibilité à l’octréotide. On retrouve les sensibles, les partiellement résistants et les totalement résistants. Quatre jours après infection, l’inhibition maximale de la sécrétion de GH sous octréotide passe de 31% à 57% en ce qui concerne les adénomes somatotropes partiellement résistants et passe de 0% à 27% pour les totalement résistants. En ce qui concerne le groupe des sensibles, l’EC50 diminue d’une manière significative. Enfin, pour les adénomes lactotropes, non répondeurs à l’octréotide in vivo, ils deviennent totalement sensibles à l’octréotide après transfert de sst2, avec une inhibition maximale de sécrétion de PRL de 43% pour une concentration d’octréotide de 1x10^-8M. La re-expression du récepteur sst2 est capable d’améliorer la sensibilité à l’octréotide. Le transfert du gène sst2 pourrait ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques en traitement combiné avec les analogues de la somatostatine.

C8 : Etude des effets de TWEAK sur la barrière hémato-encéphalique

D. Stéphan1, F. Miller2, PO Couraud2, M. Khrestchatisky1,S. Desplat-Jégo1

1 : Laboratoire NICN, UMR 6184, Faculté de Médecine Nord, Marseille 2 : Unité INSERM 567, Institut Cochin, Paris

TWEAK (TNFS12) est une protéine transmembranaire membre de la famille du TNF (Tumor Necrosis Factor) qui peut être clivée pour agir sous forme soluble. L’ARNm de TWEAK est exprimé dans de nombreux tissus alors que l’expression de la protéine semble plus restreinte. En se liant à son principal récepteur, Fn14, TWEAK peut induire la mort de certaines lignées cellulaires tumorales mais aussi la prolifération de cellules endothéliales humaines in vitro et l’angiogenèse in vivo. Des effets pro-inflammatoires de TWEAK au cours de l’inflammation du système nerveux central ont été décrits au cours de l’ Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale et leur inhibition est possible par injection systémique d’un anticorps monoclonal anti-TWEAK au moment du recrutement des cellules immunitaires à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) (Desplat-Jégo, 2005). Par ailleurs, l’injection intra-cérébrale de TWEAK désorganise l’architecture de la BHE chez la souris. Nos travaux récents indiquent que TWEAK est exprimé par les monocytes infiltrants de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) (Desplat-Jégo, 2009). L’inhibition de TWEAK pourrait donc représenter une nouvelle approche thérapeutique pour la SEP mais il reste à déterminer les processus moléculaires et cellulaires modulés par TWEAK au niveau de la BHE afin de mieux comprendre les effets protecteurs de son inhibition. Nous travaillons maintenant chez l’homme et nous utilisons un modèle in vitro de BHE constitué de cellules microvasculaires endothéliales cérébrales humaines (hMEC/D3). Nous avons montré que ces cellules expriment Fn14 et répondent à TWEAK par la sécrétion de chémokines et cytokines pro-inflammatoires. Nous nous intéressons maintenant aux effets modulateurs de TWEAK sur ce modèle de BHE par trois approches : i) réalisation par microarray et analyse bioinformatique d’une étude du transcriptome des hMEC/D3, et en particulier des voies de signalisation mobilisées, après stimulation par du TWEAK recombinant ; ii) analyse des effets du TWEAK soluble sur les propriétés de la BHE (expression des marqueurs des jonctions serrées, des molécules d’adhésion cellulaires, des chémokines et de leurs récepteurs, étude de l’activation du système MMP/TIMP) ; iii) évaluation de l’influence du degré d’expression membranaire de TWEAK par les monocytes sur leur migration transendothéliale.

Desplat-Jégo, S, et al. (2005) Anti-TWEAK monoclonal antibodies reduce immune cell infiltration in the central nervous system and severity of experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Immunol. 117(1):15-23. Desplat-Jégo, et al..(2009). TWEAK is expressed at the cell surface of monocytes during multiple sclerosis. J Leukoc Biol. 85(1):132-5. Epub 2008 Oct 22

C3 : Profil d’expression des gènes au cours de l’évolution clinique de la dépression et identification de biomarqueurs sanguins.

Raoul BELZEAUX, El Chérif IBRAHIM

NICN- CNRS UMR 6184, équipe Plasticité olfactive et réparation du système nerveux

L’objectif de cette étude est de comparer le niveau d’expression de gènes candidats chez des patients soufrant d’un épisode dépressif majeur (EDM) sévère au cours de l’évolution de la maladie et chez des sujets contrôles. Nous avons analysé l’ARNm extrait des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) à partir d’une cohorte homogène de 11 patients soufrant d’un EDM sévère avec des caractéristiques mélancoliques par la technique de qRT-PCR. Pour évaluer l’évolution de l’EDM, nous avons réalisé un prélèvement sanguin en phase aiguë et 8 semaines plus tard. Les quantifications de l’expression des ARNm ont été comparées à une cohorte de sujets contrôles sains et appariés en âge et en sexe. Pour prendre en compte les faux positifs statistiques, nous avons utilisé le calcul du « false discovery rate ». Parmi les 40 gènes candidats, suffisamment exprimés dans les PBMC, que nous avons étudiés, 13 montrent des variations significatives de leur niveau d’expression. Nous observons que des variations d’expression de certains ARNm peuvent être des biomarqueurs dépendants de l’état clinique, tels que PPM1K et TPH1. Nous observons aussi que l’expression d’autres ARNm peut être associée à l’efficacité du traitement ou à l’amélioration clinique (CREB1, GRIK5, HSPA2, HTR1B, HTR2A, IL2RG, PDLIM5, SAT1, SLC6A4/5HTT, et SYNJ2). En particulier, il existe une forte corrélation entre l’expression de 5HTT et les variations de l’intensité de la dépression. Par ailleurs, nous déterminons que l’expression d’IL10 peut être un biomarqueur indépendant de l’état. Enfin, l’analyse de 2 EDM consécutifs chez un même patient révèle des résultats comparables pour les variations d’expression de 5HTT et HTR2A. L’ensemble de ces résultats indique que le prélèvement des PBMC au cours de l’évolution d’un EDM est une méthode de choix pour décrire des biomarqueurs de la dépression.

C11 : Identification in silico d’un panel de gènes régulés par le facteur de transcription Pit-1

N. Jullien, S. Guillen, J.P. Herman, J.L. Franc

CRN2M, Département de Neuroendocrinologie-Neuroimmunologie, Faculté de Médecine Nord, Marseille

Le facteur de transcription Pit-1 est spécifique des cellules hypophysaires somatotopes, lactotropes et thyréotropes. Sa présence est nécessaire pour leurs différentiations terminales et pour la prolifération et la survie des lignages somatotrope et lactotrope. Malgré son importance dans la physiologie hypophysaire moins d’une dizaine de gènes cibles de ce facteur ont été mis en évidence. De manière à caractériser de nouveaux gènes cibles, une stratégie en deux étapes à été initié. La première étape a consisté à étudier l’impact d’une inhibition de Pit-1 sur le transcriptome des cellules GH4C1, lignée cellulaire somatolactotrope de rat. Pour ce faire ces cellules ont été infectées avec un lentivirus permettant l’expression d’un mutant dominant négatif de Pit-1 (Pit-1 R271W). Le transcriptome des cellules infectées à été comparé à celui de cellules contrôles grâce à des puces pangènomiques de rat (Affymetrix). Dans ces conditions, 1422 gènes ont vu leur expression modifiée de manière positive ou négative. Cependant cette étude est restrictive car elle ne permet pas de définir quelles sont les cibles directes de Pit-1. La deuxième étape a donc consisté à rechercher les promoteurs possédant un ou plusieurs sites de fixation pour Pit-1. Nous avons pour cela, à partir d’hypophyse de souris, utilisé la technique de ChIP-chip : immunoprécipitation de la chromatine suivie d’une hybridation sur des puces à ADN (Nimblegen) correspondant à toutes les régions promotrices (-4,5 Kb +0,5Kb) du génome de souris. Dans ces conditions, 1674 sites de fixation ont été mis en évidence. Cependant la fixation d’un facteur de transcription sur un promoteur n’implique pas obligatoirement un effet sur la transcription de ce gène. Nous avons donc croisé les résultats obtenus avec les deux approches de manière à obtenir une liste de gènes dont le niveau d’expression est modifié si l’on empêche la fixation de Pit-1 sauvage et qui possèdent un site de fixation sur son promoteur. Nous obtenons alors une liste de 96 gènes qui ont une forte probabilité d’être régulé par Pit-1. L’étude de ces gènes par fonction (« gene ontology ») permet de montrer un enrichissement significatif du nombre de gènes impliqués dans certaines d’entre elles, par exemple 28 de ces gènes sont impliqués dans l’expression génique, 4 dans la mort cellulaire, 4 dans la régulation de la transduction du signal, 4 dans le cycle de l’ubiquitine. L’étude de certains de ces gènes et des effets de Pit-1 sur leurs promoteurs permettra d’avoir une meilleure compréhension de l’effet de ce facteur de transcription dans la physiologie hypophysaire.

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