P50-57

P50

Mise au point et caractérisation fonctionnelle d’une culture de cellules de Merkel humaines.

Roudaut Yann, Rodat-Despoix Lise, Azorin Nathalie, Delmas Patrick et Crest Marcel

CNRS, UMR 6231, CRN2M

La peau est l’organe du toucher et la transduction sensorielle mécanique est assurée à la par fois des organes sensoriels spécialisés qui sont les disques de Merkel, les corpuscules de Ruffini, de Meissner et de Pacini, et par des récepteurs localisés dans les terminaisons libres des fibres nerveuses sensorielles. Dans ces terminaisons, on considère qu’une stimulation mécanique active des canaux ioniques qui forment avec des protéines partenaires des complexes moléculaires « mécanosensibles ». Ces canaux une fois ouverts dépolarisent la terminaison ce qui active des canaux dépendant du potentiel et produit des potentiels d’action constituant le message sensoriel. L’identité moléculaire de ces canaux et le fonctionnement de ces complexes demeurent néanmoins mal connus. De plus il n’existe que très peu d’études sur les récepteurs mécanosensibles des organes sensoriels spécialisés. L’objectif de ce travail était de mettre au point une méthode de culture des cellules de Merkel humaines, d’apprécier leur viabilité et de caractériser dans ces cellules la fonctionnalité des canaux ioniques sensibles à une stimulation mécanique ou thermique et celle des récepteurs aux principaux neuromédiateurs impliqués dans les interactions cellulaires cutanées. Dans ce travail, nous montrons que l’on peut utiliser l’expression de la protéine CD56 (NCAM) pour trier sur une colonne d’affinité les cellules de Merkel des autres cellules de l’épiderme, principalement les kératinocytes. Nous avons identifié un milieu de culture et un cocktail de facteurs neurotrophiques permettant la survie de 74% des cellules de Merkel pendant 3 jours. L’identité des cellules de Merkel a été confirmée par un immunomarquage avec un anticorps dirigé contre un marqueur de référence, la cytokératine 20. Plus de 95% des cellules mises en culture sont des cellules de Merkel. En utilisant une technique d’imagerie calcique par détection de la fluorescence du Fura-PE3, nous avons déterminé la réponse des cellules de Merkel à différents stimuli. Une stimulation mécanique provoquée par un choc hypo-osmotique provoque une entrée de calcium dans 38% des cellules. L’application des agonistes des canaux TRPV-1, -3, -4 et TRPM8 montre que seul le menthol, agoniste des canaux TRPM8, provoque une entrée de calcium dans 98% des cellules. Enfin nous avons identifié des récepteurs fonctionnels à l’ATP (59% des cellules), à l’histamine (45% des cellules) et à la bradykinine (20% des cellules), mais pas au glutamate qui est supposé intervenir comme neurotransmetteur entre les cellules de Merkel et les terminaisons sensorielles dans les disques de Merkel.

P51

Identification immunohistochimique et électrophysiologique de Nav1.7 dans les neurones myentériques de cochon d’Inde

Sage Dominique1, Levinson Rock2, Delmas Patrick4, Blumenthal Ken3 & Clerc Nadine4.

1 : INCI, UMR 7168 CNRS -Université Louis Pasteur, Strasbourg, F, 2 : University of Colorado, US, 3 : School of Medicine and Biomedical Sciences, SUNY at Buffalo, US, 4 : CRN2M, Dpt Signalisation Neuronale, Equipe P Delmas. Faculté de Médecine secteur Nord, Marseille

Nous avons récemment établi (Sage et al. 2007) que trois des 9 sous unités Nav 1 connues, Nav1.3, Nav1.7 et Nav1.9 se distribuent dans les neurones sensoriels, et les différents types de motoneurones et d’interneurones du plexus myentérique du cochon d’Inde. Dans le cas de Nav1.7, nos données étaient exclusivement obtenues par hybridation in situ. Nous étendons ici nos résultats en utilisant un anticorps anti-Nav1.7 fiable et en enregistrant, en patch clamp sur préparation de plexus myentérique non dissocié, le courant Nav1.7 différencié des autres Nav1 grâce à une toxine de tarentule (ProTx-II) qui l’inhibe avec une valeur d’IC50 de 3 nM contre une valeur de 30 à 150 nM pour les autres Nav1.
La sous unité Nav1.7 est exprimée par l’ensemble des neurones myentériques à l’exclusion d’une sous-population (positive pour la calrétinine). Dans la population des neurones sensoriels myentériques (positifs pour la calbindine et NeuN), elle est associée à Nav1.3 et Nav1.9. Nos enregistrements en patch clamp montrent qu’elle permet le développement de courants de rampe lors de l’application de rampes de voltage lentes (0.1 à 0.2 mV/ms ; -100 à +40 mV). Ces courants de rampe se développent à partir d’ -40 mV et atteignent une amplitude maximale de 0.5 nA. Le fait qu’ils résultent de l’activation de Nav1.7 est attesté par leur blocage par ProTx-II (0.5-1 nM). De manière remarquable, comme le courant Nav1.7 humain exprimé dans des cellules HEKs (Cummins et al. 1998), les courants de rampes sensibles à ProTx-II sont augmentés en présence de cadmium. L’aptitude de Nav1.7 à produire des courants de rampe résulte vraisemblablement de la lenteur du développement de son inactivation. Cette propriété est particulièrement adaptée à la transmission synaptique lente qui est généralisée à l’ensemble des neurones myentériques. Ref : Cummins TR, Howe JR, Waxman SG, J Neurosci. 1998, 18:9607-19.

P52

L’ARN comme langage : transmission horizontale des empreintes olfactives chez C.elegans.

Alice Soriano1, Jean-Jacques Remy1,2

1 NICN, CNRS UMR 6184, Faculté de Médecine, Université Aix-Marseille 2 USC INRA PHASE

L’empreinte sensorielle se traduit par une mémorisation permanente de l’environnement périnatal. Elle n’est possible que pendant une période limitée du développement dite période critique. Ce comportement est très conservé dans l’évolution animale. Nous avons démontré l’existence d’une empreinte de l’environnement odorant chez le nématode C. elegans. Lorsque C.elegans est exposé à un odorant attractif pendant le premier stade larvaire, il présente à l’âge adulte une attirance pour l’odorant nettement plus importante que les vers naïfs. De nombreuses données portent à croire que le vecteur de cette information mnésique est de l’ARN. Il a notamment été montré que des mutations supprimant la formation de petits ARN non-codants empêchent également l’établissement de l’empreinte (1, 2). Si l’information olfactive est effectivement portée par des ARNs, il n’est pas exclu que ces ARNs puissent diffuser dans le milieu de culture. Nous savons que l’ARN double brin peut induire l’interférence après avoir été ingéré par les nématodes (3). Dans l’hypothèse d’un transfert horizontal des empreintes par le biais de l’ARN, nous étudions le comportement de populations de vers sauvages et de vers mutés pour les canaux à ARN SID-1 et SID-2 impliquées dans le transport et la diffusion de l’ARN interférence (4, 5). Références 1- Remy J.J.RNA-mediated genetic assimilation of a learned behavior in C. elegans EMBO Conference Chromatin and Epigenetics (May 2009)
2- Remy J.J. and Hobert O. An interneuronal chemoreceptor required for olfactory imprinting in C. elegans. Science,(2006)
3 - Timmons L., Court D., Fire A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans (2001 )Gene. 4- Winston WM, Molodowitch C, Hunter CP. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1 (2002) Science.
5- Winston WM, Sutherlin M, Hunter CP. C.elegans SID-2 is required for environmental RNA interference (2006)

P53

Impacte d’une hypoxie prénatale sur la maturation du chemoreflexe respiratoire chez le rat nouveau-né

Keda TREE, Florence CAYETANOT, Julie PEYRONNET-ROUX CRN2M, UMR 6231, Aix-Marseille Université, Av. Escadrille Normandie Niemen, 13397 Marseille cedex 20

La survie des mammifères est conditionnée par le bon fonctionnement du système respiratoire qui régule les échanges gazeux (O2/CO2) au niveau pulmonaire. Cependant, la concentration des gaz dans l’environnement n’est pas stable à tout instant et lorsque ces fluctuations ont lieu pendant la période développementale du mammifère, elles peuvent affecter la mise en place du contrôle de la respiration. La maturation des réseaux neuronaux impliqués dans ce contrôle commence très tôt au cours de la gestation et persiste pendant la période postnatal. Ainsi, les facteurs environnementaux pré- et périnataux ont une influence notable sur le développement du nouveau-né et peuvent le fragiliser. Cette étude a pour but d’évaluer les effets d’une hypoxie prénatale chronique (10% O2, 15 jours) sur la maturation du chémoreflexe respiratoire chez le rat nouveau-né. Nous montrons grâce à la pléthysmographie à corps entier (in vivo) que l’hypoxie prénatale affecte la mise en place de la ventilation et de son contrôle. En effet, nous observons une augmentation de la ventilation au repos. D’autre part, l’enregistrement in vitro de la racine C4 sur des préparations « en bloc » de tronc cérébral isolé, montre que les animaux hypoxiques ont une fréquence de décharge augmentée. L’hyperventilation trouve donc certainement ses origines dans une altération du fonctionnement du générateur central de rythme. Nous nous sommes également attachés à préciser la part de l’influence centrale et de l’influence périphérique dans la réponse intégrée de l’animal exposé à une hypoxie prénatale. Pour évaluer la chémosensibilité centrale nous avons soumis l’animal à un test hypercapnique (4% CO2) en pléthysmographie. Nous montrons une importante augmentation de la chémosensibilité au CO2 puisque les animaux hypoxiques montrent une réponse ventilatoire exacerbée à l’hypercapnie. Pour évaluer la chémosensibilité péripherique, nous avons utilisé le test de Dejours (100% O+) en pléthysmographie. Nous montrons une altération de la sensibilité périphérique à l’oxygène. Il semblerait que la réinitialisation de la chémosensibilité à l’oxygène n’ait pas lieu chez ces animaux entre la naissance et P3.

P54

Regulation of Kv1 axonal targeting by phosphorylation of Kvbeta2

Helene Vacher, Jae-won Yang, Bénédicte Dargent and James S. Trimmer

INSERM 641 - IFR Jean-Roche - Marseille France

Voltage-gated potassium Kv1 channels are localized to the axon where they control action potential propagation and neurotransmitter release. Kv1 axonal targeting requires the highly conserved Kv1 T1 tetramerization domain and the association of the Kvbeta auxiliary subunits. Recent studies have shown that the interaction of the N-terminal of Kvbeta2 to the plus-end microtubule binding protein 1 (EB1) is also crucial for Kv1 targeting. However, little is known about the mechanism regulating Kvbeta2EB1interaction. Based on previous studies showing that the interaction of EB1 with its other partners was highly regulated by phosphorylation, we first identified phosphorylation sites of the auxiliary subunit Kvbeta2. The coimmunopurification of Kvbeta2 subunits was done using anti-Kv1.1 antibodies from solubilized rat brain membrane and then analyzed by mass spectrometry (LC-MS/MS). Four phosphorylation sites were unambiguously identified at the N-terminal of Kvbeta2. GST pull-down experiments showed that the phosphorylation of Kvbeta2 regulates its interaction with EB1. Moreover, the concentration of Kv1/Kvbeta2/EB1 complexes at the axon of neurons in culture was modulated by phosphorylation. These results reveal a new dynamic mechanism regulating Kv1 axonal targeting.

P55

Réflexes somato-viscéraux et motricité anorectale

Vitton V, Abysique A, Grimaud JC et Bouvier M

La prise en charge thérapeutique de l’incontinence anale sévère est un problème complexe. Néanmoins, elle a bénéficié, ces dix dernières années, d’importants progrès chirurgicaux, comme la neuromodulation par stimulation des nerfs sacrés. Cette technique consiste à stimuler la 3ème ou 4ème racine sacrée, de façon continue, à l’aide d’une électrode de stimulation implantée au contact de la racine et d’un stimulateur placé sous la peau dans la fosse iliaque ou dans la région lombaire. Cette technique donne de bons résultats ; néanmoins, son mode d’action demeure méconnu. Nous avons précédemment montré que, chez le chat anesthésié, la stimulation des afférences somatiques cheminant dans le nerf radial et le nerf sciatique entraîne une inhibition significative de la motricité colique. Cette inhibition est abolie après section des nerfs coliques lombaires contenant les fibres postganglionnaires sympathiques innervant le côlon ou après injection de phentolamine. Nos travaux ont permis de mettre en évidence au moins l’un des mécanismes à l’origine l’amélioration de la continence fécale consécutive à la neurostimulation sacrée. En effet, il semblerait que ce type de stimulation augmente la motricité du sphincter anal interne et réduise celle du colon. Ces deux effets résultent de la mise en jeu d’un réflexe somato-sympathique. Afin de vérifier que chez l’homme la stimulation des nerfs sacrés met en jeu un réflexe somatique et afin de préciser le rôle exact de l’inhibition de la motricité colique dans l’amélioration de la continence fécale chez les patients traités par neuromodulation des racines sacrées, nous avons recherché les effets de cette stimulation incontinents présentant des lésions sphinctériennes intéressant à la fois le sphincter anal interne et le sphincter anal externe. Tous les patients ont été améliorés après un mois de neuromodulation sacrée et cette amélioration a perduré pendant toute la période de suivi (3-36 mois). Nous avons observé une diminution significative d’au moins 50% du score de Wexner (score de sévérité de l’incontinence fécale), une diminution du nombre de selles et du nombre d’épisodes d’incontinence. Nos travaux indiquent donc que la stimulation des nerfs sacrés améliore la continence chez des patients présentant des lésions des sphincters externe et interne. Donc, chez l’homme comme chez l’animal, cette stimulation fait vraisemblablement intervenir des réflexes somato-sympathiques.

P56

GABA, anomalies respiratoires pré-symptomatiques et symptômes respiratoires chez un modèle murin du Syndrome de Rett Voituron Nicolas1, Zanella Sébastien1,2, Menuet Clément1, Lajard Anne-Marie1, Quintin Luc3, Dutschmann Mathias1,4, Hilaire Gérard1

1CRN2M UMR 6231, Faculté Saint-Jérôme, 13397 Marseille Cedex20 France. 2Seattle Children’s Research Institute, Center for Neuroscience & University of Washington, Neurosurgery Department, Seattle, WA 98101 USA. 3UMR 5123, 69 622 Lyon-Villeurbanne France. 4Institute of Membrane and Systems Biology, Leeds LS2 9JT, UK.

Le Syndrome de Rett est une neuropathologie développementale sévère qui concerne essentiellement les filles. Après une période périnatale apparemment normale, les patientes développent des symptômes neurologiques complexes, y compris des symptômes respiratoires avec un rythme respiratoire erratique et de fréquentes apnées. Le Syndrome de Rett est dû à des mutations du gène methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2), et des souris déficientes pour ce gène ont donc été créées comme modèle expérimental. Les souris mâles (Mecp2-/y) développent des symptômes respiratoires qui rappellent ceux du Syndrome de Rett (Viemari et al, 2005. Katz et al, 2009). Chez les souris Mecp2-/y, la respiration est normale à la naissance mais devient anormale à partir de l’âge d’un mois, avec un rythme erratique et de fréquentes apnées conduisant à une détresse respiratoire et à la mort vers l’âge de deux mois. L’apparition des symptômes respiratoires des souris Mecp2-/y est précédée de déficits précoces en noradrénaline et GABA au niveau bulbaire (Viemari et al, 2005. Medrihan et al, 2008). Une étude des paramètres respiratoires des souris Mecp2-/y par plethysmographie nous a permis de détecter des anomalies respiratoires pendant la période pré-symptomatique, c’est-à-dire bien avant l’apparition des symptômes respiratoires. En effet, dès l’âge de 15 jours, les régulations respiratoires (Voituron et al, 2009) et la respiration basale après les soupirs sont anormales chez les souris Mecp2-/y. L’administration de doses uniques de Midazolam, une benzodiazépine communément utilisée en clinique humaine pour potentialiser les effets du GABA, abolit de façon transitoire non seulement les anomalies respiratoires pré-symptomatiques des souris Mecp2-/y, mais également les symptômes respiratoires lorsqu’ils sont déclarés. Notre hypothèse est que les déficits précoces en GABA des souris Mecp2-/y altèrent l’intégration des messages respiratoires périphériques au niveau du noyau du tractus solitaire et initient des anomalies respiratoires pendant la période pré-symptomatique, ce qui contribue ultérieurement au développement des symptômes respiratoires. Nous envisageons donc de soumettre de jeunes souris Mecp2-/y à des traitements chroniques au Midazolam afin de compenser leurs déficits GABA, d’entraver l’apparition des anomalies respiratoires pré-symptomatiques et de retarder l’apparition, ou d’amoindrir la sévérité, des symptômes respiratoires à venir.

P57

La libération d’endocannabinoïdes induite par la dépolarisation des neurones du noyau dorsal moteur du nerf vague régule de manière différentielle la neurotransmission inhibitrice et excitatrice.

Wanaverbecq N, Roux J, Lebrun B, Jean A et Trouslard J

Université Paul Cézanne, Université de la Méditerranée, CRN2M - UMR 6231, USC-INRA 2027 Département de Physiologie Neurovégétative Faculté des Sciences et Techniques St Jérôme Marseille France

Le complexe vagal dorsal (CVD) et l’hypothalamus représentent deux structures cérébrales majeures impliquées dans le contrôle de la prise alimentaire. Le CVD est situé dans la partie caudale du tronc cérébral et est constitué de trois structures neuronales interconnectées : le noyau du tractus solitaire (NTS), l’aire postrémale (AP) et la partie dorsal du noyau moteur du nerf vague (DMNX) contenant les corps cellulaires des neurones préganglionnaires parasympathiques qui projettent vers et contrôle la sphère entéro-gastrique. Au cours des dix dernières années, de nombreuses données expérimentales ont mis en évidence la modulation de la prise alimentaire et du contrôle de poids corporel par le système des endocannabinoïdes (EC) grâce à un important rôle oréxigénique. Les EC représentent une famille de neurotransmetteurs atypiques qui sont synthétisés et libérés « à la demande » par la cellule postsynaptique. Une fois libérés les EC agissent de manière rétrograde via des récepteurs couplés à des protéines Gαi/o, tels que les récepteurs CB1 (CB1R), et inhibent la libération de neurotransmetteurs au niveau des terminaisons présynaptiques. Dans cette étude, nous avons testé l’hypothèse que les neurones du DMNX représenteraient une source d’EC au niveau du CVD. Pour cela, à l’aide de la technique électrophysiologique de patch-clamp dans des tranches coronales de tronc cérébral de souris adulte, nous avons recherché si les neurones du DMNX exprimaient un phénomène de DSI (depolarization-induced suppression of inhibition) ou de DSE (depolarization-induced suppression of excitation). En effet, la DSI et la DSE correspondent à des phénomènes de plasticité à court terme associés à une action inhibitrice rétrograde des EC libérés par un neurone de manière dépolarisation-dépendante. Nos résultats démontrent pour la première fois que les neurones du DMNX induisent le phénomène de DSI dont l’induction dépend d’une élévation du calcium intracellulaire dans ces-mêmes neurones et dépend de l’activation des CB1R présents sur les terminaisons GABAergiques. Ces résultats suggèrent également que les neurones du DMNX représentent une source potentielle d’EC dans le CVD.

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