P11-P29

P20

Modulation de la fidélité de la décharge neuronale par l’activité GABAergique et les endocannabinoïdes

Franck Dubruc & Olivier Caillard

INSERM UMR 641 - IFR Jean Roche - Marseille France

Les neurones pyramidaux sont constamment bombardés par une activité GABAergique spontanée qui régule le comportement de décharge neuronal. Des résultats récents ont montré que cette activité spontanée GABAergique pouvait moduler l’excitabilité mais aussi la fidélité temporelle de décharge d’un neurone définie comme sa capacité à reproduire à l’identique un patron de décharge lors de la présentation répétée d’un même stimulus. D’autre part, de nombreuses études ont mis en évidence ces dernières années l’existence d’une plasticité à court-terme de l’activité GABAergique médiée par les endocannabinoïdes. Ce phénomène, connu sous le nom de DSI (Depolarization-induced Suppression of Inhibition) a été décrit dans de nombreuses structures comme le cervelet, le cortex ou encore l’hippocampe. Nous avons étudié quelles pouvaient être les conséquences fonctionnelles de la production d’endocannabinoïdes sur l’activité neuronale et en particulier sur la fidélité de la décharge des neurones pyramidaux de la région CA1 de l’hippocampe. Dans un premier temps nous montrons que l’activité GABAergique régule le comportement de décharge des cellules de lieu de l’hippocampe. Dans un second temps que la décharge de ces cellules induit, via la voie de signalisation des endocannabinoïdes, une diminution de la libération spontanée de GABA. Enfin nous observons que cette diminution transitoire de la transmission GABAergique est associée à une amélioration de la fidélité de la décharge. Les cellules pyramidales de la région CA1 sont donc capables de moduler la fidélité temporelle avec laquelle elles émettent des potentiels d’Action, par un mécanisme de rétrocontrôle diffusible faisant intervenir les endocannabinoïdes.

P21

Importance du métabolisme mitochondrial dans l’altération des fonctions gliales dans la chorée de Huntington

Pascale Dupont, Marie-Thérèse Besson et Jean-Charles Liévens

Equipe Interactions Neurone-Glie, CRN2M-UMR6231

La chorée de Huntington est une maladie héréditaire autosomique dominante caractérisée par l’apparition progressive de désordres moteurs et de troubles émotionnels, voire de démences. Elle est due à une répétition anormale de codon CAG dans l’exon1 du gène huntingtine. Les études dans le domaine de la chorée de Huntington ont eu, pour la plupart, pour but direct de comprendre les mécanismes intrinsèques qui conduisent au dysfonctionnement et/ou la mort des neurones dans cette maladie. Très récemment, il a été admis que les fonctions des cellules gliales pouvaient aussi être directement affectées par la Huntingtine mutée (mHtt) et ainsi contribuer à la pathogenèse. Notre but est de comprendre l’importance des interactions neurone-glie dans la chorée de Huntington et d’en disséquer les mécanismes en utilisant comme modèle d’étude, la drosophile. L’expression de mHtt sélectivement dans les cellules gliales entraîne des déficits moteurs et une létalité importante des drosophiles. De plus, les drosophiles présentent une sensibilité anormale au stress mécanique. Suite à un choc mécanique, elles manifestent une paralysie et/ou des crises hyperactives. Ce phénotype reflète l’incapacité des drosophiles à mettre en œuvre le réflexe de fuite dans une situation de danger. Ce réflexe repose normalement sur une coordination motrice précise des muscles du vol et du saut contrôlés par le circuit des « fibres géantes ». Nous avons entrepris une étude électrophysiologique et nos derniers résultats montrent que la présence de mHtt dans la glie altère l’activité des fibres géantes dans des conditions de forte demande. Une telle sensibilité au stress mécanique a été précédemment décrite pour des mutations de gènes affectant le métabolisme énergétique mitochondrial chez la drosophile. Cependant, nous n’avions alors aucune idée de la contribution des cellules gliales et des neurones dans ce phénotype. Nous avons montré que l’inactivation dans la glie de l’expression du gène codant la riboprotéine mitochondriale (technical knockout) ou du gène codant la translocase des nucléotides adényliques (stress sensitive B) induit une sensibilité anormale au stress mécanique. Ces résultats démontrent pour la première fois que l’altération du fonctionnement des mitochondries dans la glie peut être responsable du phénotype de sensibilité au stress mécanique. Il est ainsi tentant de proposer que le métabolisme mitochondrial puisse jouer un rôle crucial dans la pathologie d’origine gliale dans notre modèle de la chorée de Huntington. Un crible génétique est en cours pour vérifier cette hypothèse.

P22

Synaptic plasticity in the nucleus tractus solitarii : Role of endocannabinoid receptors

Hanad FARAH and Fabien TELL

Equipe Intégration des informations viscérales Centre de recherche en Neurophysiologie-Neurobiologie de Marseille. UMR CNRS 6150

The nucleus tractus solitarii (NTS), a brainstem structure, is a gateway for many primary visceral afferents. The NTS forms part of the neural circuits responsible for basic functions such as respiration and digestion, but it also relays information to higher brain regions devoted to homeostatic regulations. Within this physiological context, we have begun to investigate synaptic procession at excitatory synapses between visceral afferent fibers and NTS neurons. Whole-cell recordings on brainstem slices in adult rats provided evidence for long term changes in synaptic gain after paring stimulation of afferents fibers (4 Hz, 4 min) and NTS neurons moderate depolarizations (-30 mV). This protocol induced a long term depression (LTD) of evoked excitatory postsynaptic current (eEPSC). Quantal analysis (Paired-pulse ratio ; PPR and coefficient of variation ; CV ) suggested that the LTD was due to reduced release probability. Application of NMDA receptors antagonist (APV) or cannabinoïd antagonist (AM51, 10 ?M) prevented the induction of LTD and quantal parameter changes. Surprisingly, direct activation of cannabinoïd receptors by WIN 55,212-2 induced a depression of eEPSCs but without any changes in quantal parameters suggesting a post-synaptic mechanisms. Altogether, these results demonstrated the presence of LTD in NTS synapses involving both NMDA ans cannabinoïd receptors.The locus of this LTD (pre vs post-synaptic or both) remains to be elucidated.

P23

Plasticité neurovégétative consécutive aux traumatismes spinaux.

Marie-Solenne Félix, Fannie Darlot, Sylvian Bauer, Valéry Matarazzo

CRN2M, UMR 6231, Aix-Marseille Université, Av. Escadrille Normandie Niemen, 13397 Marseille cedex 20

L’existence d’une plasticité post-lésionnelle permettant un certain degré de récupération fonctionnelle après lésion spinale est un concept nouveau. Notre objectif est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de cette plasticité post-lésionnelle, sur un modèle animal de lésion cervicale partielle présentant une récupération de la fonction respiratoire après un délai de trois mois. Nous avons réalisé cette étude principalement au niveau d’une région du tronc cérébral : le Complexe Vagal Dorsal (CVD). Bien qu’éloignée du site de la lésion, cette région intervient dans la régulation de l’activité respiratoire et possède un foyer de neurogenèse. Nous avons ainsi émis l’hypothèse que le CVD présente des changements de neurogenèse et d’activité des facteurs de transcription lors de ces processus de plasticité post-lésionnelle. Nous avons tout d’abord réalisé une étude comparative de la prolifération cellulaire dans les foyers de neurogenèse adulte : zone sous-ventriculaire, hippocampe, moelle épinière, et, avec une attention particulière, au niveau du CVD. Cette étude comparative a été réalisée à 7 jours (période de moindre récupération fonctionnelle) et 3 mois post-lésionnels (période de récupération fonctionnelle). Au stade 3 mois, le devenir cellulaire neuronal a pu être mesuré par co-marquage BrdU et HuC/D. Nous montrons, en particulier dans le CVD, une augmentation de la neurogenèse à 3 mois post-lésionnels. Nous avons ensuite réalisé, sur ces groupes d’animaux et à l’aide de puces à ADN/Protéine, un criblage différentiel de l’activité d’une vingtaine de facteurs de transcription au niveau du tronc cérébral. Ce criblage nous a permis de découvrir une inhibition significative de l’activité du facteur de transcription FKHR (Forkhead in Rhabdomyosarcoma). De plus, nous montrons par immunohistochimie que FKHR est exprimé dans le CVD. Sachant que FKHR est connu pour être impliqué dans les processus d’apoptose, ce résultat vient renforcer notre hypothèse selon laquelle le tronc cérébral, et plus particulièrement le CVD, met en jeu des mécanismes moléculaires favorisant la survie et la croissance cellulaire après lésion cervicale.

P24

La signalisation anorexigène du complexe vagal dorsal inhibe la déglutition rythmique, composante motrice du comportement alimentaire.

Félix Bernadette1, Trouslard Jérôme2, Bariohay Bruno2, Tardivel Catherine1, Jean André1,2

Centre de Recherche en Neurobiologie-Neurophysiologie de Marseille, CRN2M, 1INRA USC-2027, CNRS UMR-6231 Université de la Méditerranée Université Paul Cézanne2, Département de Physiologie NeuroVégétative, Faculté des Sciences et Techniques de St Jérôme, Marseille, 13013 France

Il est classiquement admis que le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique est organisé de façon hiérarchisée à travers 1) des mécanismes à court terme qui contrôlent la taille des repas via les signaux de satiété (remplissage gastrique, CCK…) et les afférences vagales agissant sur le complexe vagal dorsal (CVD) situé dans le bulbe rachidien, 2) des mécanismes à long terme qui contrôlent le poids corporel via des signaux d’adiposité (leptine, insuline) agissant sur des structures hypothalamiques, 3) des voies anorexigènes et orexigènes en provenance de l’hypothalamus et à destination du bulbe rachidien, qui contrôlent la satiété réflexe et dont les cibles ne sont pas clairement identifiées. Néanmoins, d’autres résultats remettent en question cette notion d’un contrôle hiérarchique, suggérant une régulation plus distribuée au travers d’interconnections réciproques entre l’hypothalamus et le bulbe rachidien. Sur la base de ces données, nous avons étudié l’action de signaux anorexigènes tels que la leptine et le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) sur l’activité des prémotoneurones déglutiteurs. Le CVD contient plusieurs programmateurs centraux (CPG) responsables des comportements moteurs de l’ingestion et en particulier celui de la déglutition. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle de déglutition rythmique déclenché par des stimulations électriques répétitives du nerf laryngé supérieur (NLS). Nous avons ainsi montré qu’une microinjection de leptine ou de BDNF dans le CPG de la déglutition, entraîne une inhibition qui est rapide, réversible et dose dépendante. Cette inhibition résulte d’une activation des récepteurs à la leptine et TrkB, respectivement. Il est intéressant de noter que pour inhiber la déglutition, la signalisation BDNF-TrkB met en jeu un mécanisme GABAA dépendant. De plus, le taux de BDNF contenu dans le CVD qui est modulé par l’état nutritionnel et augmenté par les hormones anorexigènes (leptine, CCK), se trouve diminué par la stimulation du NLS qui déclenche des déglutitions. En conséquence, le BDNF peut-être considéré comme un intégrateur commun pour les feedbacks tant positifs que négatifs qui contrôlent la prise alimentaire au niveau du CVD.

P25

Une carence prénatale en vitamine D modifie de manière paradoxale la réponse trans-générationnelle à l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Diana Andrea Fernandes de Abreu, El Chérif Ibrahim, José Boucraut, Michel Khrestchatisky, François Féron

NICN, UMR CNRS 6184, IFR 11, Faculté de Médecine, Université de la Méditerranée, Marseille, France.

De très nombreuses données épidémiologiques indiquent qu’une insuffisance en vitamine D durant la gestation pourrait être un facteur de risque pour la Sclérose en plaques (SEP). Pour tester cette hypothèse, nous avons mis au point un modèle murin de déficience développementale en vitamine D (DVD). Des souris femelles C57Bl/6 ont été alimentées avec une nourriture carencée en vitamine D, six semaines avant la conception et pendant toute la durée de la gestation. Après la mise-bas, les mères et leur progéniture (F1 DVD) ont été alimentées avec de la nourriture contenant de la vitamine D (1 500 UI/kg). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle animal de SEP, a été induite avec le peptide MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) chez les souris femelles adultes (12 semaines) de la génération F1 (F1 DVD) et de la génération F2 (F2 DVD). Après l’observation du décours des symptômes pendant 30 jours, nous avons mesuré, par PCR quantitative, l’expression de transcrits candidats impliqués dans i) la machinerie de la vitamine D (récepteurs nucléaire et cytosolique de la vitamine D, VDR and MARSS), ii) l’homéostasie du système immunitaire (IL1, IL2, IL4, IL10, IL17, IL23, TNFalpha, IFNgamma, TGFbeta, TLR2), et iii) la myélinisation (MOG). Nous avons également recherché une expression anormale d’ARN messagers pour des gènes candidats issus d’études pan-génomiques et pan-protéomiques réalisées antérieurement par l’équipe (HSa5, HSa8, HSP90, FKBP1a, PPP3, PSMA2). Nos résultats indiquent qu’une déficience développementale en vitamine D modifie de manière significative la réponse à l’EAE. Contrairement à notre hypothèse, les souris F1 DVD ont développé une EAE plus tardive et moins sévère. Inversement, les souris F2 DVD ont été plus sévèrement touchées et de manière plus précoce que les animaux contrôles. Ces observations surprenantes ont été confirmées au niveau moléculaire par des variations d’expression de gènes qui jouent un rôle important dans la myélinisation et l’inflammation. Au 30ème jour post-immunisation, l’expression de la MOG et de cytokines inflammatoires (ostéopontine, TNF-alpha) est demeurée stable chez les souris F1 DVD tandis qu’elle était fortement augmentée chez les souris contrôles. Par ailleurs, nous avons observé que des protéines de choc thermique (HSa5, HSa8, HSP90) et les récepteurs à la vitamine D (VDR et MARRS) pourraient être les médiateurs de cette résistance à l’EAE. Notre étude démontre qu’une hypovitaminose D maternelle modifie le développement embryonnaire et constitue pour la première génération un facteur de protection et, pour la deuxième génération, un facteur de risque vis à vis de l’EAE.

P26

Immunoquantification de protéines membranaires par SPR

Géraldine FERRACCI1, Séverine MARCONI2, José BOUCRAUT3, Gisèle ALCARAZ2, Michael SEAGAR2 et Christian LEVEQUE1,2

1CAPM, 2INSERM UMR641, 3CNRS CNR2M, Institut Jean Roche

Localisées à l’interface des compartiments subcellulaires, les protéines membranaires assurent des fonctions essentielles et constituent des cibles pharmacologiques primordiales. Peu abondantes et fortement hydrophobes, ces protéines sont difficilement analysables et quantifiables par des méthodes biochimiques conventionnelles. Nous montrons que l’utilisation de biocapteurs optiques fondés sur la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) constitue une approche de choix pour la détection et l’analyse des protéines membranaires. En utilisant des anticorps spécifiques, il est possible de détecter ces composants membranaires avec une sensibilité de l’ordre du picomolaire. Les mesures sont réalisées en une seule étape (temps d’analyse inférieur à 5 minutes), sans solubilisation préalable et avec de faibles quantités d’échantillons (cellules en cultures, coupes de cerveau de rat, biopsies). La gamme dynamique de concentration mesurable est très étendue (facteur 1000). De plus, contrairement à d’autres méthodes comme l’ELISA, la méthode est peu ou pas dépendante de l’affinité de l’anticorps pour l’antigène membranaire. Cette stratégie a été appliquée pour la détection et la quantification de protéines membranaires intracellulaires impliquées dans le mécanisme présynaptique d’exocytose. La mesure par SPR de l’immuno-capture de ces protéines issues de préparations membranaires natives ou de lysat provenant de cellules en culture préalablement exposées aux neurotoxines botuliques nous a permis d’établir des méthodes de dosages in vitro très sensibles de leurs activités protéolytiques. Des essais de détection d’épitopes extracellulaires ont également été réalisés avec succès à partir de lysats de cellules transfectées. La sélectivité obtenue pour les cibles transfectées est comparable à celle obtenue par cytométrie de flux. Nous testons actuellement la pertinence de la méthode pour la quantification de protéines membranaires très peu représentées comme les canaux ioniques à partir de coupes de cerveau de rat. Ces travaux montrent ainsi l’intérêt de l’utilisation de la SPR pour la détection et la quantification rapide et sensible des protéines membranaires in situ.

1- A label-free biosensor assay for the detection of botulinum neurotoxin B in food and human serum, 2009, Ferracci G., Marconi S., Mazuet C., Jover E., Seagar M. , Popoff M., LévêqueC. (soumis pour publication) 2- A protein chip membrane-capture assay for botulinum neurotoxin activity, 2008, Marconi S., Ferracci G., Berthomieu M., Kozaki S., Miquelis R., Boucraut J., Seagar M., Lévêque C. Toxicol Appl Pharmacol., 233, 439-446 3- Synaptic vesicle chips to assay botulinum neurotoxins, 2005, Ferracci G., Miquelis R., Kozaki, S., Seagar M., Lévêque C. Biochem. J. 391, 659-666

P27

Cinétique du contrôle nerveux autonome pendant et après la respiration de 100% d’oxygène chez le jeune adulte sain

Ombeline GARGNE, Yoann GOLE, Mathieu COULANGE, Jacques BESSEREAU, Yves JAMMES, Alain BOUSSUGES.

UMR MD2, Physiologie et Physiopathologie en Conditions d’Oxygénation Extrêmes (P2COE), Université de la Méditerranée et Institut de Recherche Biomédicale des Armées Antenne Toulon

Inhaler une forte pression partielle d’oxygène entraîne des effets hémodynamiques significatifs qui seraient liés à des changements de l’activité nerveuse autonome. Nous avons étudié pendant combien de temps ces effets persistaient. Dix hommes sains volontaires ont respiré, en double aveugle, soit de l’air médical soit 100% d’oxygène grâce à un masque facial pendant quarante cinq minutes. Le rôle de l’activité nerveuse autonome pendant et après l’exposition au gaz a été évalué par analyses spectrales de la fréquence cardiaque et de la pression sanguine. Les faibles (0,04-0,15Hz) et hautes (0,15-0,4Hz) fréquences normalisées ont été analysées avant et pendant l’exposition au gaz puis à dix, trente, soixante et quatre-vingt dix minutes après cette exposition. Pendant les mesures, le volontaire respirait à quinze cycles par minute. Aucun changement significatif n’a été observé pendant une exposition à l’air médical. Les pressions sanguines, systoliques et diastoliques, ne sont pas significativement modifiées pendant et après l’exposition à l’oxygène. Cependant, la fréquence cardiaque diminuait significativement pendant cette exposition à l’oxygène. Chez les jeunes adultes sains, une exposition à 100% d’oxygène normobare n’affecte pas la pression sanguine mais entraîne une baisse de la fréquence cardiaque. L’activité nerveuse sympathique du contrôle vasomoteur diminue pendant une exposition à l’oxygène. Ces changements persistent pendant 10 minutes après l’arrêt de cette exposition. L’activité parasympathique augmente pendant l’hyperoxie et le système nerveux autonome de l’activité cardiaque est modifié jusqu’à 30 minutes après l’exposition à l’oxygène.

P28

Plasticités synergiques et homéostatiques de l’excitabilité des neurones de la région CA1 de l’hippocampe

Célia Gasselin, Dominique Debanne

INSERM U641, IFR Jean Roche, Université de la Méditerranée, Marseille, France

Un des enjeux en neurobiologie est de comprendre le substrat cellulaire de l’apprentissage et de la mémoire. Aujourd’hui la synapse est reconnue comme étant le site privilégié du stockage de l’information dans le cerveau. Cependant, toute la plasticité n’est pas uniquement d’origine synaptique : des modifications de l’excitabilité des neurones prennent part à la constitution de voies privilégiées d’activité dans le cerveau. Par exemple, des changements d’excitabilité des neurones pyramidaux CA1 ont été rapportés à la suite de l’induction de la Potentialisation (LTP) et de la Dépression à Long-Terme (LTD) de la transmission synaptique. Ces plasticités sont synergiques, c’est-à-dire que la LTP est associée à une augmentation de l’excitabilité alors que la LTD s’accompagne d’une diminution d’excitabilité (Daoudal et al.PNAS 2002). Si cette synergie est utile dans des conditions physiologiques, elle peut représenter un problème à l’échelle du réseau conduisant soit à la saturation, soit à l’extinction de l’activité dans le réseau. Une solution adoptée par le neurone est de mettre en œuvre une plasticité compensatoire, dite homeostatique, de l’excitabilité neuronale qui ramène l’activité vers des niveaux physiologiques de fonctionnement. On comprend mal aujourd’hui la nature des relations existant entre les plasticités synergique et homéostatique de l’excitabilité intrinsèque. Alors qu’un continuum a été récemment démontré entre ces deux plasticités dans les neurones pyramidaux CA1 à la suite de l’induction de la LTP (Campanac et al. J Neurosci 2008), on ignore encore la nature de leurs liens pour le versant LTD. Un des déterminants de l’excitabilité est la résistance d’entrée apparente qui est contrôlée par plusieurs courants dépendants du potentiel comme le courant cationique activé par l’hyperpolarisation (Ih). Nous avons donc examiné les changements de résistance d’entrée (Rin) dans les neurones pyramidaux CA1 de l’hippocampe in vitro induits par des stimulations répétées des collatérales de Schaffer à basse fréquence (3 Hz, 5 min), pour induire différents niveaux de LTD. Nous montrons que Rin dimininue à la suite du premier épisode de stimulation qui induit une faible LTD alors qu’elle augmente pour les derniers épisodes de stimulation, produisant une LTD de grande amplitude. Ainsi, nos résultats suggèrent la présence d’un continuum entre les plasticités synergiques et homéostatiques de l’excitabilité neuronale.

P29

Inhibition des canaux Nav1.8 et Nav1.9 par le menthol : possible rôle dans l’analgésie

Christelle Gaudioso, Jizhé Hao, Patrick Delmas. CRN2M, CNRS UMR 6231, Université de la Méditerranée, CS80011.Bd Pierre Dramard, 13344 Marseille Cedex 15, France.

L’utilisation de traitements par voie topique pour soulager des douleurs articulaires ou musculaires est largement répandue. Le menthol en formulation topique a trouvé des bases d’utilisation rationnelles avec la mise en évidence de ses effets analgésiques. Le menthol est connu pour agir sur le canal TRPM8 qui est responsable de la détection du froid chez les mammifères (Bautista et al., 2007). Cependant comment le menthol produit ses effets analgésiques demeure énigmatique. Nous avons précédemment mis en évidence que les canaux Nav1.8 et Nav1.9 étaient des acteurs majeurs de l’électrogenèse des nocicepteurs et participent au codage du message douloureux. Nous avons donc testé l’hypothèse que l’effet analgésique du menthol pourrait également s’expliquer par un blocage des courants sodium TTX-résistants dans les neurones sensoriels des ganglions rachidiens. Par des enregistrements en patch clamp sur des cultures primaires de rat, nous avons mis en évidence que le menthol inhibe les courants Nav1.8 et Nav1.9. Pour le canal Nav1.8, cette inhibition augmente pour des potentiels de maintien plus dépolarisés et avec la fréquence de stimulation, de façon proportionnelle avec la fraction de canaux inactivés. Cette inhibition se traduit par une diminution de la conductance et un déplacement des courbes d’inactivation rapide et d’inactivation lente vers des potentiels plus hyperpolarisés. Pour le canal Nav1.9, cette inhibition s’accompagne d’un déplacement de la dépendance au potentiel de l’inactivation lente vers des potentiels plus négatifs. Ces données suggèrent que l’effet analgésique du menthol pourrait être causé par l’inhibition des courants Nav1.8 et Nav1.9 par un mécanisme qui vise à stabiliser leurs états inactivés.

1. Bautista DM, Siemens J, Glazer JM, Tsuruda PR, Basbaum AI, Stucky CL, Jordt SE, Julius D. (2007). The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature 448:204-208.

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