Plates-Formes de Recherche en Neurosciences

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Plates-formes PFRN

P10-P19

P10

Les protéines de stress protègent contre le stress oxydatif induit par la double agression : hyperoxie normobare et exercice fatigant

Christelle Brerro-Saby, Stéphane Delliaux, Jean-guillaume Steinberg, Alain Boussuges, Yoann Gole, Yves Jammes.

UMR MD2 P2COE, IFR Jean Roche, Faculté de médecine, Marseille

Introduction :
En normoxie, un handgrip statique soutenu jusqu’à épuisement induit un stress oxydant qui persiste au moins 20 minutes après l’exercice [1]. En outre, nos études antérieures ont montré que la combinaison d’une hypoxie aigüe ou chronique et d’un effort fatiguant supprime le stress oxydatif post exercice [2] [3]. Dans la présente étude nous avons émis l’hypothèse que le même phénomène peut s’observer en combinant l’hyperoxie normobare et un exercice fatiguant. L’objectif étant de rechercher l’implication des protéines de stress dans ce phénomène protecteur.

Méthodes :
L’étude a porté sur huit volontaires sains. Des prélèvements veineux ont été faits au cours de 3 conditions expérimentales, au repos sous oxygène pur, lors d’un exercice de handgrip maximal en condition normoxique et en condition hyperoxique. Nous avons mesuré les concentrations plasmatiques d’un marqueur de la peroxydation membranaire lipidique, (substances réactives à l’acide thiobarbituric ou TBARS), d’un antioxydant endogène (acide ascorbique réduit ou RAA) et des protéines de stress (Hsp27), puissant agents anti-oxydant, dans les conditions de normoxie et à différents moments d’ne période de 50 min d’exposition à l’oxygène pur.

Résultats :
En Normoxie, le handgrip produit un stress oxydatif avec une production de TBARS et une consommation de RAA sans augmentation significative des Hsp27 En hyperoxie, chez le sujet au repos la concentration des TBARS s’élève, on mesure une consommation de RAA et une augmentation significative de Hsp27. Quand les sujets réalisent le handgrip en hyperoxie, on observe une suppression du stress oxydatif post-exercice. La production de Hsp27 est alors doublée. Conclusion : L’exercice statique supprime le stress oxydatif en réponse à l’hyperoxie comme lors de l’exposition hypoxique. Il semble que la combinaison de deux circonstances extrêmes (dysoxie et exercice) pourrait induire une réponse adaptative qui protège le muscle contre une production excessive des espèces réactives de l’oxygène. L’hyperproduction des Hsp suffirait à expliquer ce phénomène. [1] Brerro-Saby et al. Muscle and Nerve, 2008 [2] Dousset et al. Free Radical Res 2002 [3]Steinberg et al. Respir Physiol Neurobiol, 2004.

P11

Les changements de la commande sensorimotrice du muscle sous l’hyperoxie normobaric chez l’homme.

Christelle Brerro-Saby, Stéphane Delliaux, J.G Steinberg et Yves Jammes

UMR MD2 P2COE, IFR Jean Roche, Faculté de médecine, Marseille

Introduction :
Nous avons précédemment montré chez l’homme que l’hyperoxie hyperbare induit un stress oxydant, facilite la conduction neuromusculaire en réduisant le temps de conduction et en augmentant l’amplitude du potentiel évoqué musculaire complexe (onde M) [1]. Dans une autre étude (présentée dans le colloque actuel) nous avons prouvé que l’hyperoxie normobare induit également un stress oxydant. Dans cette étude, nous avons voulu savoir si l’hyperoxie normobare modifiait également l’onde M mais aussi les réflexes spinaux (réflexe de Hoffman). Nous avons également mesuré la réponse tonique à la vibration (TVR) qui explore la boucle reflexe proprioceptive [2] Méthodes :
Chez huit sujets au repos, nous avons mesuré au niveau du muscle fléchisseur des doigts la TVR et l’onde M avec le réflexe H au niveau du nerf médian en normoxie, et durant une période de 50 minutes d’exposition à l’oxygène pur. Résultats :
En condition de repos, l’hyperoxie normobare réduit de façon significative le temps de conduction neuromusculaire et augmente l’amplitude de l’onde M. L’hyperoxie normobare réduit également la latence du réflexe H mais ne modifie pas l’amplitude de la TVR. Conclusion :
Ces données montrent que l’hyperoxie normobare facilite la conduction nerveuse périphérique et centrale. Nous avons récemment montré que les radicaux libres de l’oxygène activent les fibres musculaires métabosensibles du groupe IV et il est bien connu que l’activation de ces afférences est à l’origine de la dépression de la commande fusoriale. En conséquent ce phénomène pourrait contrebalancer les phénomènes d’hyperexcitabilité, expliquant ainsi que la TVR ne soit pas modifiée par l’hyperoxie.

[1] Jammes Y, Arbogast S, Faucher M, Montmayeur A, Tagliarini F, Meliet JL, Robinet C. Formation image de Clin Physiol Funct. 2003, 23:149 - 54 [2] Brerro-Saby C., S. Delliaux, J.G. Steinberg, Y. Jammes. Muscle et nerf 2008, 38:1481 - 89.

P12

L’hyperoxie prolongée diminue la respiration mitochondriale en modifiant la fonctionnalité des complexes transporteurs d’électrons des muscles oxydatifs chez le rat

Brerro-Saby Christelle, Delliaux Stéphane, Jammes Yves

UMR MD2 P2COE, IFR Jean Roche, Faculté de médecine, Marseille

Introduction :
L’hyperoxie induit un stress oxydant en augmentant la production cellulaire des substances réactives dérivées de l’oxygène (ROS). Il est connu que les ROS altèrent l’ultrastructure mitochondriale et probablement aussi leur fonctionnalité, qui est ROS-dépendante. Cette étude avait pour objectif de vérifier l’hypothèse d’une réduction de la fonction mitochondriale en hyperoxie. Méthodes :
Chez 23 rats adultes, nous avons mesuré la pression partielle artérielle en oxygène (PaO2) et la respiration mitochondriale des muscles squelettiques par polarographie (électrode de Clark). Sur des fibres de soléaire (muscle oxydatif) et de gastrocnémien (muscle glycolytique) perméabilisée par la saponine, nous avons mesuré la consommation d’oxygène de base (Vo), la consommation d’oxygène maximale (Vmax, explorant le complexe I) et les activités des complexes III et IV explorées par les réponses respiratoires à la roténone et l’antimycine. Chez sept de ces animaux, les muscles prélevés ont été exposés pendant 30 min soit à une solution contenant 100% d’O2 (hyperoxie aigue), soit à une solution contenant 21 % d’O2 (normoxie). Les seize autres rats ont respiré pendant 24 h l’air ambiant (normoxie) ou de l’oxygène pur (hyperoxie prolongée). Résultats :
Comparé à la condition de normoxie, l’exposition de 30 min à l’oxygène pur n’a pas modifié la respiration mitochondriale (soléaire : 1,61±0,13 µmol/O2/min/mg de poids sec ; gastrocnemien : 1,54±0,14 µmol/O2/min/mg de poids sec). Par contre, chez les rats exposés pendant 24 h à l’hyperoxie, dans les deux groupes de muscles Vo est sensiblement accrue, Vmax n’est pas modifié et le rapport Vmax/Vo est significativement diminué (soléaires : -10% ; gastrocnemien : -15%). Pour le seul muscle soléaire des rats hyperoxiques, l’inhibition par la roténone et l’antimycine des complexes I et III a été significativement plus importante et cet effet était proportionnel à la valeur de PaO2 (complexe I : R = 0,79, p < 0,001 ; Complexe III : R = 0,9, p < 0,001). Conclusion :
L’exposition aigue à l’hyperoxie n’a apparemment aucune incidence sur la respiration mitochondriale des muscle squelettiques striés par contre l’hyperoxie prolongée diminue la respiration mitochondriale des muscles oxydatifs en modifiant la fonctionnalité des complexes transporteurs d’électrons.

P13

Expression différentielle et rôle des MMPs dans la motilité des astrocytes et de la microglie dans la cicatrice gliale.

Eliane Charrat, Yatma Gueye, Adlane Ould-yahoui, Oualid Sbai, Jean-Jacques Risso1, Vincent Dive2, Emmanuel Fenouillet, Michel Khrestchatisky, Santiago Rivera.

NICN, UMR6184 CNRS-Université de la Méditerranée, Marseille. 1 Département de Recherche Marine et Subaquatique, IMNSSA, UMR MD2 PPCOE, Université de la Méditerranée, Toulon Armées. 2 Département d’Ingénierie des Protéines, CEA-Saclay.

La cicatrice gliale formée après traumatisme cérébrale ou de la moelle épinière représente une véritable barrière physico-chimique qui empêche la régénération axonale et la récupération fonctionnelle. Des travaux précédents, incluant ceux de notre équipe, ont montré que des changements de l’équilibre entre les protéases matricielles (MMPs) et leurs inhibiteurs tissulaires (TIMPs) contrôlent le remodelage tissulaire post-lésionnel et influencent l’issue des processus neuro-dégénératifs. Cependant, très peu d’information existe sur l’implication du système MMP/TIMP dans la migration des principales cellules composant la cicatrice - astrocytes et microglie- et dans les interactions cellule gliale-axone endommagé. L’étude des événements protéolytiques qui contrôlent le remodelage tissulaire dans ces conditions est de grande importance pour mieux comprendre la genèse de la cicatrice et l’échec concomitant de la régénération axonale. Nous avons implémenté un modèle de culture cellulaire qui combine la génération d’une cicatrice gliale et l’axotomie des ganglions rachidiens dorsales (GRD) afin d’étudier : i) le profile d’expression des MMPs dans les cellules gliales et le rôle de ces protéases dans leur motilité après lésion ; ii) les interactions entre les axones des GRD et les cellules gliales ainsi que le rôle des MMPs dans le contrôle de ces interactions. Le présent travail présente des preuves d’une implication différentielle des MMPs dans la motilité d’astrocytes et cellules microgliales et révèle un rôle prééminent de ces dernières dans l’inhibition de la repousse axonale via un mécanisme qui impliquerait l’activité des MMPs.

P14

Rôle des récepteurs NK3 aux tachykinines dans l’activité motrice digestive spontanée chez la souris.

Copel Carine, Patrick Delmas, Clerc Nadine et Mazet Bruno.

CRN2M – CNRS UMR 6231, Faculté de Médecine secteur Nord, CS80011, Bd P.Dramard, 13344 Marseille

Introduction
Des mécanismes réflexes différents, tous organisés dans le système nerveux entérique (SNE) sont impliqués lors de la motricité intestinale en période postprandiale et en période inter-digestive. Dans les réponses motrices postprandiales, il est admis que les tachykinines (TK) endogènes agissent sur les récepteurs NK3 (rNK3) exclusivement lors de distensions extrêmes ou de conditions pathologiques. Le rôle de rNK3 dans l’activité inter-digestive demeurait inconnu. Cette activité se caractérise par des ondes de contractions lentes et régulières qui parcourent le tube digestif dans le sens oral-aboral : les complexes moteurs migrants (CMM). Matériel et Méthodes
Nos expériences sont réalisées sur le colon de souris, placé dans une cuve à organe perfusée par une solution physiologique à 35-36°C et oxygénée. L’activité mécanique du muscle circulaire colique est enregistrée simultanément en 3 points équidistants. L’effet d’un antagoniste des rNK3 (SB 257553 ; 2 µM), appliqué via la perfusion du bain, a été testé sur les CMM dans 12 préparations. Résultats
Dans nos conditions expérimentales, toutes les préparations expriment des CMM se produisant avec une période moyenne de 155 ± 45 sec en conditions contrôles et augmentée en présence de SB 257553 (182 ± 51 p<0,05). La période moyenne des CMM a augmenté de 21% pour 9 préparations ; elle est restée constante pour les 3 autres. Le coefficient de variation (CV= écart-type/moyenne), qui représente la dispersion relative d’une variable autour de la moyenne, a diminué d’un facteur 1,3 à 4 pour 5 des 9 préparations présentant une augmentation de période et s’est avéré constant pour les 4 autres. Pour 2 des 3 préparations avec une période inchangée par l’antagoniste, le CV diminuait d’un facteur 2 et 3, respectivement. Conclusions et Perspectives
Nos résultats préliminaires montrent que l’activation des rNK3 diminue et régularise la fréquence des CMM, ce qui peut engendrer une diminution significative de la durée du transit colique. Ils apportent la première mise en évidence d’un effet modulateur tonique des tachykinines sur la motricité digestive spontanée. A l’échelle cellulaire, notre laboratoire a également montré que l’excitabilité des neurones sensoriels du SNE est augmentée par l’activation des rNK3 qui modulent les canaux sodium de type NaV1.9. Nous testerons l’implication de ces canaux, et par là de ces neurones, dans l’organisation des CMM en utilisant des souris KO n’exprimant pas le canal NaV1.9. Nos résultats pourraient constituer une piste pour une nouvelle approche dans l’étude des mécanismes à l’origine des perturbations de la motricité intestinale observées dans les troubles fonctionnels digestifs.

P15

Dysfonctionnement métabolique et altération de la barrière hémato-encéphalique.

Cornille Emilie, Abou-Hamdan Mhamad, Khrestchatisky Michel, de Reggi Max, Gharib Bouchra.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est essentielle à l’homéostasie du cerveau, par son rôle de barrière sélective entre le sang et le parenchyme cérébral, mais aussi par les réactions enzymatiques dont elle est le siège. Elle est constituée de cellules endothéliales liées entre elles par des jonctions serrées, et elle est doublée par une enveloppe astrocytaire. Toutes les maladies neurodégénératives s’accompagnent, à des degrés divers, d’une altération de cette structure. Les phénomènes inflammatoires sont souvent mis en avant, mais nous voulons mettre l’accent sur un aspect relativement méconnu, lié aux désordres métaboliques. Bien que le glucose soit la source énergétique principale du cerveau, celui-ci, dans des conditions pathologiques, a la faculté de faire appel à une source alternative, que constituent les acides gras. Nous avons exploré cette voie métabolique dans le modèle MPTP murin de la maladie de Parkinson. Nous avons montré que la neurotoxine induit une inhibition de l’expression et de l’activité de l’enzyme mitochondriale L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogénase, qui participe à la catalyse de la -oxydation des acides gras. Elle génère des corps cétoniques (ketone bodies, KB), source d’énergie sous la forme de NADH. Cette inhibition est maximale de j2 à j4 après intoxication des souris et, de fait, elle coïncide avec une diminution des taux circulants de KB ; elle coïncide aussi avec les premiers signes d’altération de la BHE. L’administration de pantéthine, précurseur du coenzyme A (CoA) rétablit l’activité et l’expression de l’enzyme et accroît très significativement les taux de KB sanguins. En même temps, elle maintient l’intégrité de la BHE. Ceci établit un parallèle entre le « boost » énergétique provenant de l’oxydation des acides et la protection de la BHE.

Ce travail sera poursuivi et complété par d’autres modèles murins, où il semble que la stimulation du métabolisme lipidique soit associée à la protection de la BHE (collaboration Delphine Depoix, Muséum d’Histoire Naturelle, Paris).

P16

Etude de la neuroplasticité respiratoire suite à une lésion spinale cervicale haute unilatérale

Fannie Darlot, Florence Cayetanot, Valéry Matarazzo, Anne Kastner

CRN2M, UMR 6231, Université Aix-Marseille 3, Faculté Saint Jérôme, Av Escadrille Normandie Niémen, 13397 Marseille Cedex 20 France

Une lésion spinale a des conséquences souvent irréversibles sur le fonctionnement de l’organisme ; cependant, des études récentes ont montré qu’après une lésion partielle, des processus de plasticité peuvent aboutir à un certain degré de restauration fonctionnelle. Cette étude a pour objectif de mettre en évidence et d’analyser la réorganisation bulbospinale du réseau respiratoire, chez le rat adulte, suite à une lésion partielle de la moelle épinière. Cette lésion cervicale latérale est pratiquée du côté latéral, au niveau du métamère C2, de telle sorte à interrompre, du côté lésé (gauche), la majeure partie des voies respiratoires bulbospinales descendantes innervant les motoneurones phréniques (C3-C6) et à induire une paralysie de l’hémi-diaphragme gauche. Chez ces animaux, une récupération fonctionnelle de la respiration apparaît progressivement après la lésion, d’abord par la mise en jeu de voies respiratoires contralatérales (non lésées), puis à long terme, par un « nouveau » circuit spinal situé dans la partie médiane de la moelle épinière. Nous recherchons actuellement l’origine de cette réorganisation du réseau après une lésion chronique en utilisant les techniques de traçage neuronal antérograde (FluoroRuby) et rétrograde (FluoroGold) pour détecter la localisation et le trajet des voies bulbaires centrales descendantes, et l’origine des fibres spinales qui innervent les motoneurones phréniques.

P17

Développement de molécules vecteurs qui passent la barrière hémato-encéphalique.

Marion David1, Aude Fortoul1, Karima Bakloul1, Yves Molino1, Françoise Jabes1, Emmanuel Fenouillet, Régis Guieu2, Patrick Vlieghe1 et Michel Khrestchatisky.

UMR 6184, Faculté de Médecine Nord. 1 - Société VECT-HORUS SAS, Faculté de Médecine secteur Nord, Bd Pierre Dramard, 13916 Marseille Cedex 20. 2- Laboratoire de Biochimie, Faculté de Médecine Bd Jean Moulin 13005, Marseille.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un des obstacles majeurs au traitement de maladies du système nerveux central car elle prévient l’entrée de nombreux médicaments dans le cerveau. Certains récepteurs exprimés au niveau de la BHE sont capables d’effectuer de la transcytose, c’est-à-dire d’amener leur ligand du pôle apical (côté lumen du vaisseau sanguin) vers le pôle basal (côté parenchyme nerveux) de la cellule endothéliale. Notre équipe a pour objectif de trouver des molécules capables d’interagir avec ces récepteurs et d’emprunter la voie de la transcytose afin de les développer comme vecteurs de médicaments. Des cribles hauts débits réalisés à l’aide de banques de peptides sur des récepteurs de la BHE ont permis de caractériser une famille de peptides capables de transporter des charges (peptide S-Tag, anticorps) à l’intérieur des cellules, et de passer la BHE, in vitro et in vivo. Des phases d’optimisation chimique de nos vecteurs, basées notamment sur des approches de Ala scan et de D scan et l’utilisation d’amino-acides non naturels ont été entreprises afin de réduire la taille de nos vecteurs, améliorer leur affinité pour leurs récepteurs, leur stabilité et leur biodisponibilité. Le vecteur le plus abouti a été couplé, via différents linkers, à un peptide anti-douleur qui ne passe pas la BHE. Après radiomarquage (collaboration CEA) et des expériences de « in situ brain perfusion » (collaboration INSERM U705), nous obtenons nos premières preuves de concept in vivo quant à la pertinence de la vectorisation via les molécules vecteurs en cours de développement.

P18

GM1 ganglioside binds to the serotonin-1A receptor and regulates its activity in a central nervous network.

Eric Di Pasquale,* Jacques Fantini, *Aurore Giraudin,** Nouara Yahi,* Sylvie Espanet,* Jean-Claude Stamegna,* Didier Morin**

*Université Paul Cézanne (Aix-Marseille 2 & 3), Centre de Recherche en Neurobiologie et Neurophysiologie de Marseille, CNRS UMR 6231, INRA USC 2027, Equipe Interactions Moléculaires et Systèmes Membranaires, Faculté des Sciences et Techniques de Saint-Jérôme, Service 331, 13997 Marseille Cedex 20, **Université Bordeaux 1 & 2, UMR CNRS 5227, Mouvement Adaptation Cognition, 146 rue Leo Saignat, Zone Nord, Bat. 2A, Université Bordeaux2, 33076 Bordeaux cedexFrance.

Gangliosides are widely expressed in the nervous system and involved in major brain functions including neuronal plasticity and synaptic activity. A functional regulation by exogenously added gangliosides has been shown for several G-protein-coupled-receptors but not yet for serotonin receptors. Here, we tested the hypothesis that circulating GSLs could modulate the activity of 5-HT1A-receptors. Computational sequence searches allowed identifying a putative sphingolipid-binding-domain on the second extracellular loop of the 5-HT1A-R. A synthetic peptide derived from this domain interacted with reconstituted monolayers of GM1. We demonstrate that exogenous, but not endogenous GM1, is co-immunoprecipited with the native receptor, consistent with a trans interaction between the cellular 5-HT1A-R and extracellular GM1. Among other GSLs (GD1a, Gb4, GT1b, GalCer), GM1 is the most efficient at increasing the respiratory frequency on en-bloc in vitro preparations used as a spontaneously active synaptic network regulated by 5-HT1A-Rs. Experiments with forskolin and pertussis toxin showed that GM1 effect was c-AMP-dependent. A specific 5-HT1A-R antagonist (p-MPPF) blocked the effect of GM1 whereas the β-subunit of cholera toxin did not. This strengthens our view that GM1 is a trans regulator of 5-HT1A-Rs. A molecular model is proposed to integrate the convergent effects of GM1 and serotonin on the 5-HT1A-R.

P19

Caractérisation des cellules neurales exprimant Rae-1

Mehdi djelloul, Natalia Popa, Florence Pelletier, José Boucraut

Centre de Recherche en Neurobiologie-Neurophysiologie de Marseille, UMR-CNRS 6231 Faculté de Médecine - Secteur Nord. Université de la Méditerranée CS 80011. Bd Pierre Dramard 13344 Marseille Cedex 15, France

Rae-1 (Retinoic early induced transcript 1) est une molécule apparentée au CMH-1 (Complex majeur d’histocompatibilité de classe 1) exprimée dans le système nerveux murin embryonnaire. Son expression disparait dans le système nerveux central (SNC) adulte, sauf au niveau des zones périventriculaires notamment la zone sous ventriculaire (SVZ). Par contre, on observe une induction de son expression dans le bulbe olfactif après lésion chirurgicale ou chimique. Cette induction corrèle avec un recrutement de cellules immunes notamment des cellules exprimant NKG2D, le récepteur activateur de Rae-1. Notre objectif est de caractériser in vitro et in vivo la nature des cellules qui expriment Rae-1 et les mécanismes moléculaires à l’origine de la répression et de l’induction de Rae-1. Les cellules souches neurales expriment Rae-1. Cette expression disparait après entrée en différenciation de ces cellules en neurones, astrocytes et oligodendrocytes. L’induction en différenciation des neurosphères est proposée comme modèle d’étude sur lequel nous évaluons l’implication respective des promoteurs et des régions 3’UTR dans la répression de l’expression de Rae-1. De plus nous observons que la microglie réactive exprime aussi des transcrits de Rae-1. Elle représente une deuxième cible potentielle des cellules immunes qui infiltrent le SNC en condition pathologique.

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